地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

[摘要] 酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶，在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据，克

>> 粘质沙雷氏菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的体外表达 杨梅黄酮对大鼠下丘脑谷氨酸脱羧酶65、组按1型受体及Hypocretin　2型受体基因表达的影响 了解蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA―2A）与谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）在1型糖尿病（DM）中的检出率及其诊断价值 谷氨酸脱羧酶抗体滴度与糖尿病患者胰岛功能关系的研究 初发2型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体相关因素分析 谷氨酸脱羧酶抗体和血、尿C肽在糖尿病中的临床应用 血清谷氨酸脱羧酶抗体在慢性乙型肝炎诊断中的临床应用价值探究 地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析 棉花S―腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析 浅谈S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆表达与分离纯化 膀胱肿瘤中受体酪氨酸激酶基因的表达及临床意义 褐飞虱ABCG基因的克隆与表达分析 草莓NBS-LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析 龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析 洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析 小立碗藓Ran基因的克隆与表达分析 白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因（AsAACT）的克隆与表达分析 铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析 人参中苯甲酸胁迫响应基因WRKY7的克隆与表达分析 太子参玉米黄质环氧化酶基因的克隆与表达分析 常见问题解答 当前所在位置：l）查找基因开放阅读框（ORF）。应用NCBI结构域在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析氨基酸序列保守结构域。采用SWISSMODEL（http：///）进行蛋白质二级结构分析和三维建模。氨基酸多序列联配用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），进化树构建利用在线分析软件MAFFT和离线软件MEGA 6.0软件进行。

1.5 诱导子处理 课题组以发根农杆菌A4诱导的温855毛状根转化系855A41（继代12次）为处理材料，培养20 d后添加诱导子。诱导子种类和终浓度为：水杨酸（SA）25 μmol・L-1，Ag+ 15 μmol・L-1，茉莉酸甲酯（MeJA）15 μmol・L-1，腐胺（Put）15 μmol・L-1。分别在添加诱导子后3，9，12，24 h取样，在液氮中保存，以未添加诱导子的毛状根转化系为对照。

1.6 基因表达量检测 提取地黄组织和诱导子处理的毛状根的总RNA用于qRTPCR检测。所用PCR仪器为BIORAD IQ5（伯乐，上海）。根据选取候选RgTyDC基因的CDS序列信息设计特异引物5′ACCGTCTGCTTCTGCATATC3′和5′TACCCGATTCGTTAATCGCC3′（扩增产物长度为124 bp）。以地黄TIP41like蛋白编码基因（RgTIP41，GenBank注册号KT306007.1）为内参基因，引物序列为5′TGGCTCAGAGTTGATGGAGTG3′和5′TCTCCAGCAGCTTT CTCGGA3′。实时荧光定量分析试剂盒为SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus） （Takara，大连）。PCR扩增体系：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，Forward Primer（10 μmol・L-1）1 μL，Reverse Primer（10 μmol・L-1）1 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，共计25 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。参考文献[11]根据BIORAD iQ5 软件生成的Ct（cycle threshold）值，以2ΔΔCt计算RgTyDC基因的相对表达量

2 结果与分析

2.1 RgTyDC基因克隆 在地黄转录组数据库中，通过同源搜索、拼接和延伸，获得Unigene7381，Unigene15405，Unigene10894，Unigene71250共4个片段，大小分别为704，530，801，893 bp，然而序列拼接并不能获得完整的ORF。NCBI上BLASTn分析发现Unigene7381_All和Unigene10894可能是地黄TyDC的5′端，包含起始密码子ATG，另外2个序列Unigene15405和Unigene71250可能是TyDC的3′端，包含终止密码子TAA。分别在4个片段上设计特异引物，合成后的引物按照同样的比例混合后用于PCR扩增，结果获得1条在1 000～2 000 bp的条带（图2），测序结果表明片段长度为1 619 bp，包含1个1 530 bp的ORF，编码509个氨基酸，命名为RgTyDC。序列已经提交到NCBI，GenBank登录号为KU640395。

2.2 RgTyDC的序列特征分析 应用ExPASy（http：///protparam/）计算发现RgTyDC蛋白的相对分子质量为56.6 kDa，等电点pI 6.25。应用NCBI在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析其保守的结构域，发现从第12至507 aa为保守结构域PLN02880，注释为酪氨酸脱羧酶；从第96 aa至502 aa含有1个多巴脱羧酶家族（DOPA_deC_like family）蛋白结构域。与已经发表的人类（Homo sapiens）、野猪（Sus scrofa）、拟南芥的TyDC/DODC进行多序列联配，发现它们之间共享保守的结构域Pyridoxal_deC，地黄RgTyDC与人、野猪、拟南芥TyDC/DODC的序列一致性分别为42%，42%，56%（图3）。

下划线显示Pyridoxal_deC结构域，箭头显示保守的激活位点赖氨酸K残基，星号显示与激活位点作用的天冬氨酸D残基；其他物种的TyDC/DoDC登录号如下：HsDODC（Homo sapiens），NP_000781.1；SsDODC（Sus scrofa），NP_999019.1；AtTyDC（Arabidopsis thaliana），NP_849999.1。

2.3 RgTyDC的3D结构预测 用SWISSMODEL在线软件http：///interactive）进行3D建模结果显示，RgTyDC蛋白空间上包含22个α螺旋和14个β折叠。同时发现，RgTyDC蛋白与已经发表的野猪多巴脱羧酶蛋白1js6.1.A的三级结构[12]十分相似，序列同源性为45.67%，用于建模的氨基酸残基范围为21～507位（图4）。

2.4 RgTyDC的系统进化分析 利用地黄RgTyDC蛋白的氨基酸序列在NCBI上进行BLASTp同源搜索，获取19个物种的TyDC/DODC/AADC蛋白。以MAFFT对它们与RgTyDC进行多序列联配，用MEGA 6.0软件以NeighborJoining算法进行bootstrapping分析，构建系统发生树（图5），结果把20个蛋白分为2个大类群，5个动物TyDC同源蛋白和15个植物TyDC同源蛋白分别聚在一起，符合物种进化规律。

地黄、猴面花Erythranthe guttata、芝麻Sesamum indicum这3种植物均属于管状花目，RgTyDC与SiTyDC，EgTyDC的序列一致性最高，均为88%，聚在同一分支，可信度为99%。马铃薯Solanum tuberosum、野生烟草Nicotiana sylvestris和野生番茄S. pennellii均为茄科植物，其同源蛋白属于同一类群Ⅲ。高粱Sorghum bicolor和水稻同为单子叶禾本科植物，SbTyDC，OsTyDC属于同一类群Ⅳ。另外，大豆Glycine max GmTyDC和野生大豆G. soja GsTyDC聚在一起。

2.5 RgTyDC基因在地黄不同组织中的表达 以地黄RgTIP41基因作为内参，采用定量qRTPCR分析RgTyDC基因在地黄不同组织中的表达量，结果表明，RgTyDC基因在检测的6个地黄组织中均有其他物种TyDC/DoDC的登录号如下：SiTyDC（Sesamum indicum），XP_011096642.1；Oe（Olea europaea），AFS28699.1；Vv（Vitis vinifera），XP_010655699.1；St（Solanum tuberosum），AHI16968.1；At（Arabidopsis thaliana），NP_849999.1；Gm（Glycine max），XP_003535055.2；Os（Oryza sativa），NP_001059509.1；Sb（Sorghum bicolor），XP_002459778.1；Ac（Aristolochia contorta），ABJ16446.1；Gs（Glycine soja），KHN22980.1；Eg（Erythranthe guttata），EYU19150.1；Tc（Theobroma cacao），XP_007041097.1；Ns（Nicotiana sylvestris），XP_009773392.1；Sp（S. pennellii），XP_015068377.1；Ss（Sus scrofa），NP_999019.1；Hs（Homo sapiens），NP_000781.1；Dr（Danio rerio），NP_998507.1；Mm（Mus musculus），NP_057881.1；Dm（Drosophila melanogaster），NP_724489.1。

RgTyDC的表达量。结果表明，在添加SA后RgTyDC的表达量在各个检测时间均极显著高于未添加对照，12 h达到最高，为未处理对照的25.02倍，说明SA能够诱导RgTyDC的表达。添加Ag+后9 h，RgTyDC的表达量略高于对照，24 h时约为对按照的0.44倍，其他时间点相比对照没有变化。添加MeJA后检测的各个时间点RgTyDC的表达量均高于对照，3 h时为对照的16.76倍，之后表达量逐渐降低，24 h时约为对照的1.88倍，说明MeJA也能够诱导RgTyDC的表达。添加Put后3 h，RgTyDC的表达量高于对照（为对照的4.28倍），9 h降低为对照的2.11倍，12 h和24 h与对照没有差异（图7）。

3 讨论

酪胺和多巴胺是合成异喹啉类生物碱和苯乙醇苷前体，是在TyDC和DODC脱羧酶作用下酪氨酸和多巴脱去羧基后生成的[8]。TyDC（EC 4.1.1.25）和DODC（EC 4.1.1.28）都属于氨基酸脱羧酶，Sandmeier等[13]把它们都归为第Ⅱ组。这类氨基酸脱羧酶在包括细菌、真菌、动物、植物不同物种中都比较保守，其氨基酸序列具有较高的一致性[13]。本研究发现地黄TyDC与人、猪的DODC序列一致性均高于

40%，与拟南芥TyDC的序列一致性为56%，而与管状花目植物猴面花、芝麻TyDC的序列一致性更是高达88%。多序列联配发现地黄、拟南芥、人和猪的同源蛋白存在非常保守的结构域（图3）。同时在进化上符合物种进化规律，动物和植物之间的序列一致性较高，亲缘关系近的物种聚在一起。

前人研究发现，植物中TyDC基因具有组织表达特异性，而且与以酪氨酸为前体的次生代谢产物积累有较强的相关性。TyDC1在罂粟根中表达量较高，TyDC2在罂粟根和茎中表达量较高，2个基因在叶中表达都很弱[8]。红景天苷主要在红景天根中积累，TyDC基因在根中表达量较叶片高，红景天苷含量高的株系TyDC基因的表达量也高[9]。地黄TyDC基因在叶片中表达量较块根高，毛蕊花糖苷含量叶片高于块根[14]，这说明RgTyDC可能参与地黄毛蕊花糖苷的生物合成。

TyDC基因还能够响应诱导子的诱导而提高表达，进而调控下游次生代谢产物的合成。在拟南芥中，干旱和受伤均能够诱导TyDC基因的表达，而低温、盐、热和黑暗则不同程度抑制TyDC基因的表达[6]。TyDC基因在大花红景天Rhodiola crenulata在SA和MeJA处理后的毛状根中表达量都有增加，SA处理的表达量增加幅度最大，毛状根红景天苷含量也在2种诱导子处理后大幅提高，且SA处理的红景天苷含量增幅最大[15]。本实验中，SA和MeJA处理后，地黄毛状根中RgTyDC的表达量均极显著增加，不同的是SA处理12 h RgTyDC表达量增幅最大，MeJA处理后3 h RgTyDC表达量增幅最大。这与前人的研究结果类似，说明RgTyDC可能编码一个参与地黄苯乙醇苷类成分生物合成的关键限速酶。

[参考文献]

[1] 郭冠瑛，王丰青，范华敏，等. 地黄化感自毒作用与连作障碍机制的研究进展[J]. 中国现代中药，2012，14（6）： 35.

[2] Jiménez C， Riguera R. Phenylethanoid glycosides in plants： structure and biological activity [J]. Nat Prod Rep， 1994， 11（6）： 591.

[3] 李行诺， 周孟宇， 沈培强， 等. 生地黄化学成分研究[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（22）： 3125.

[4] 颜贵卉， 田金虎， 龙本文， 等. 肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的研究进展[J]. 中南药学， 2012 （9）： 692.

[5] Morikawa T， Ninomiya K， Kuramoto H， et al. Phenylethanoid and phenylpropanoid glycosides with melanogenesis inhibitory activity from the flowers of Narcissus tazetta var. chinensis [J]. J Nat Med， 2016， 70（1）： 89.

[6] Lehmann T， Pollmann S. Gene expression and characterization of a stressinduced tyrosine decarboxylase from Arabidopsis thaliana [J]. FEBS lett， 2009， 583（12）： 1895.

[7] Park S， Lee K， Kim Y S， et al. Induced tyramine overproduction in transgenic rice plants expressing a rice tyrosine decarboxylase under the control of methanolinducible rice tryptophan decarboxylase promoter [J]. Bioprocess Biosyst Eng， 2012， 35（1/2）： 205.

[8] Facchini P J， De Luca V. Differential and tissuespecific expression of a gene family for tyrosine/dopa decarboxylase in opium poppy [J]. J Biol Chem， 1994， 269（43）： 26684.

[9] Gyrgy Z， Jaakola L， Neubauer P， et al. Isolation and genotypedependent， organspecific expression analysis of a Rhodiola rosea cDNA encoding tyrosine decarboxylase [J]. J Plant Physiol， 2009， 166（14）： 1581.

[10] 杨瑞仪，曾庆平. 马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆，测序及同源性分析[J]. 广州中医药大学学报，2005， 22（2）： 152.

[11] 王丰青，周艳，黄勇，等. 地黄扩展蛋白基因RgEXPA10的克隆与表达分析[J]. 药学学报， 2015， 50（2）： 233.

[12] Burkhard P， Dominici P， BorriVoltattorni C， et al. Structural insight into Parkinson′s disease treatment from druginhibited DOPA decarboxylase [J]. Nat Struct Biol， 2001， 8（11）： 963.

[13] Sandmeier E， Hale T， Christen P. Multiple evolutionary origin of pyridoxal5′phosphate dependent amino acid decarboxylases [J]. Eur J Biochem， 1994， 221（3）： 997.

[14] 边宝林，王宏洁，杨健. 5 种不同药材中毛蕊花糖苷的含量比较 [J]. 中国中药杂志，2010， 35（6）： 739.

[15] Lan X， Chang K， Zeng L， et al. Engineering salidroside biosynthetic pathway in hairy root cultures of Rhodiola crenulata based on metabolic characterization of tyrosine decarboxylase [J]. PLoS ONE， 2013， 8（10）： e75459.