内阿片肽在“双固一通”针法保护缺血心肌中的作用

内阿片肽在“双固一通”针法保护缺血心肌中的作用

【关键词】 心肌缺血;“双固一通”针法;延髓头端腹外侧区;纳洛酮;心肌超微结构

【摘要】 目的 探讨延髓头端腹外侧区(rvlm)内阿片肽在“双固一通”针法电针对家兔心肌缺血损伤保护效应中的作用。方法 本研究在“双固一通”针法对家兔急性心肌缺血保护作用的基础上，观察rvlm内微量注射纳洛酮后电针对急性心肌缺血家兔心电图及心肌细胞超微结构的影响。结果 rvlm内微量注射纳洛酮对正常家兔心肌功能和结构无明显影响，“双固一通”针法电针对缺血心肌具有一定的保护作用，能显著改善心肌缺血时心肌超微结构和心电图的变化(p<0.05)，该作用可被纳洛酮所减弱(p<0.05)，但不具有完全阻断作用。结论 “双固一通”针法对急性缺血心肌细胞具有保护效应，其作用与rvlm内源性阿片肽系统的介导有关。

【关键词】 心肌缺血;“双固一通”针法;延髓头端腹外侧区;纳洛酮;心肌超微结构

【abstract】 objective to detect the role of endogenous opioid peptides of rostral ventrolateral medulla (rvlm) in the protective effect of shuangguyitong electroacupuncture on rabbit′s acute myocardial ischemia. methods on the base of the protective effect of shuangguyitong electroacupuncture on acute myocardial ischemia model in rabbits, electrocardiography (ecg) and myocardial ultrastructures of rabbit′s ischemic myocardial cell after microinjection naloxone into rvlm were observed. results microinjection naloxone into rvlm had no influence to normal rabbit′s myocardial function and myocardial ultrastructures and little influence to ischemic myocardial function. shuangguyitong electroacupuncture had significant protective effect on acute ischemic myocardium in rabbits. shuangguyitong electroacupuncture could markedly promote recovery of st segment(p<0.05)and obviously reduce the degree of ischemic myocardium injury. the protective effect could be weakened by microinjection with naloxone in rvlm(p<0.05), but couldn′t be completely blocked. conclusions the effect of shuangguyitong electroacupuncture in ameliorating acute myocardium ischemia in rabbits is mediated by opioid receptors in rvlm.

【key words】 myocardial ischemia;shuangguyitong therapy;rostral ventrolateral medulla;naloxone;myocardial ultrastructures

在心肌缺血等多种应激状态下，内源性阿片肽大量释放，参与多种病理、生理过程，发挥心肌缺血的保护效应〔1〕。针刺具有抗心肌缺血损伤作用，能改善冠心病患者心功能，促进缺血心肌损伤的恢复〔2〕。针刺抗心肌缺血作用与内源性阿片肽有关，在侧脑室内注射阿片受体拮抗剂纳洛酮能阻断电针的抗心肌缺血损伤效应〔3〕。我们在前期实验中采用以固护正气、治病求本的“双固一通”针法开展研究，结果显示，“双固一通”针法较单纯选用“内关”针刺方法治疗心肌缺血的作用效果更好〔4〕。本实验通过延髓头端腹外侧区(rvlm)内微量注射纳洛酮，观察“双固一通”针法抗心肌缺血损伤时对心电图和心肌细胞超微结构的影响，探讨rvlm内阿片肽介导在电针抗心肌缺血保护效应的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康清洁级日本大耳白兔40只，体重2.0～2.5 kg，雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。随机分为4组，每组10只:对照组：只手术，rvlm注射生理盐水，不造模不针刺;模型组：rvlm注射生理盐水，造模后，不针刺;电针组：rvlm注射生理盐水，造模后，“双固一通”针法电针治疗;纳洛酮组：rvlm注射纳洛酮，造模后，“双固一通”针法电针治疗。

1.2 动物模型建立

20%乌拉坦(5 ml/kg)静脉麻醉动物，仰卧位固定，常规肢体ⅱ导联心电图监测，作气管插管，接动物呼吸机行人工呼吸(呼吸频率45次/min，潮气量15 ml/kg，吸呼比值5∶4)。胸前壁开胸，暴露心脏，剪开心包膜，在冠状动脉前降支，于左室壁上、中1/3交界处结扎，左室前壁发绀及心电图s?t段抬高、t波高耸作为心肌缺血标志。心电信号输入bl?420e+生物信息记录系统记录。

1.3 取穴及针刺方法

经穴定位按动物穴位图，于腓骨小头下取“足三里”穴;于脐下取“关元”穴;于前肢内侧，在腕关节后的尺、桡骨之间骨缝处取“内关”穴。针刺治疗：以“关元”、双侧“足三里”为双固穴，双侧“内关”作为随证通泻用穴，选用华佗牌不锈钢针，向下直刺，g?6805ⅱ型治疗仪进行电针治疗(疏密波8～80 hz，疏密波转换14次/min，强度0.5～1 ma，以肢体轻微颤动为宜，针刺15 min后去电针仪继续留针10 min)。

1.4 rvlm内微量注射方法

家兔仰位固定于wk?2型脑立体定位仪，将气管与食管结扎剪断，使头侧断端翻向口端固定。以棉球填塞阻断颈深静脉防止出血，暴露枕骨，骨钻钻空，用咬骨钳扩大孔径。剪破硬脑膜，用盐水棉条吸出、引流脑脊液，暴露延髓腹外侧侧面，表面用38℃液体石蜡浸浴。自盲孔向尾端(5.0±1.5) mm，中线外(3.0±1.0) mm，深度<1 mm定位rvlm。将充有生理盐水或纳洛酮溶液(3 nmol/μl，生理盐水稀释)的玻璃微电极(尖端直径为100 μm)固定在三维推进器上，用硅胶管连接于10 μl的微量注射器，双侧rvlm注射2 μl溶液。实验结束后在注药部位注入1%膀胺天蓝0.2 μl,取脑做冰冻切片检查注药部位，不在该脑区的资料弃去不用。

1.5 心肌组织超微结构的观察

实验结束后，用锐利刀片取左心室结扎线下方心肌组织，置入2.5%的戊二醛磷酸缓冲液(ph7.4)中，切分为大小约1 mm×1 mm×1 mm小块固定24 h，组织经漂洗、脱水、环氧树脂包埋、lkb ⅴ型超薄切片机切片(片厚600～700 a)、染色后在h?600型透射电镜下观察心肌超微结构，拍片，每个标本拍片3张。

1.6 数据处理

各组实验数据以x±s表示，组内比较、组间比较采用t检验，数据使用spss11.0软件分析。

2 结 果

2.1 各组家兔心电图st段、t波的变化

各组家兔rvlm内微量给药后，心电图在给药前后st段电位、t波均无差异性改变(p>0.05)，提示纳洛酮在中枢内对正常家兔心电图无明显影响。在整个观察期内，对照组心电图无明显变化，其余各组在造模后即刻st段显著抬高，t波高耸(p<0.01)，在结扎后15 min时达到高峰。模型组在整个观察期内心电图变化无明显好转，而电针组st段、t波电位减低，结扎后45 min与最高峰有明显差异(p<0.05)，结扎后60 min与模型组有显著差异(p<0.05)，说明电针具有促进心肌缺血损伤恢复的作用。纳洛酮组st段、t波电位也有减小，但变化较慢，在结扎后60 min时与最高峰相比有明显差异(p<0.05)，与模型组比较无差异(p>0.05)，但st段、t波电位仍较电针组高(p<0.05)。说明rvlm内注射纳洛酮后能明显削弱电针改善缺血心肌的损伤效应，对电针具有一定的阻断作用，但纳洛酮并不能完全阻断电针效应。见表1，表2。

2.2 各组家兔心肌组织超微结构变化

电镜下观察，对照组显示正常心肌超微结构，表现为心肌肌纤维整齐，肌丝及肌小节结构清晰可见，线粒体排列整齐，嵴清晰，不肿胀，血管内皮结构完整，管腔内可见红细胞存在。模型组心肌细胞呈现缺血性损伤改变，心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊乱，肌原纤维断裂并可见闰盘处变性;线粒体明显肿胀，峭断裂;血管内皮细胞肿胀严重，吞饮小泡明显减少，电子密度不均匀，部分内皮细胞核与胞体分离等。电针组缺血区心肌细胞肿胀较轻，肌原纤维排列整齐，肌丝清晰，基本无断裂，线粒体肿胀较轻，未见线粒体峭断裂情况，血管内皮细胞轻度肿胀，吞饮小泡丰富。纳洛酮组心肌细胞变化较模型组稍好，但仍可见心肌细胞肿胀变化，肌原纤维排列部分呈现紊乱，肌丝可见断裂，线粒体肿胀较轻，线粒体峭也出现部分断裂，血管内皮细胞肿胀。结果说明，“双固一通”针法对缺血心肌超微结构的损伤具有明显改善作用，rvlm内微量注射纳洛酮具有减弱针刺效应的作用。见图1。表1 各组家兔不同时刻心电图st段电位的变化表2 各组家兔不同时刻心电图t波的变化图1 各组家兔心肌组织超微结构变化(铅铀双重染色，×15 000)

3 讨 论

实验研究表明，针刺能改善心肌缺血后心肌结构的变化，促进心肌恢复正常代谢，调整心肌收缩力,纠正心律失常〔5〕。前期的实验中发现，“双固一通”针法治疗心肌缺血时有着显著的治疗效果〔6〕。

rvlm是交感心血管活动整合的重要中枢，其中一些神经元的活动直接兴奋前交感神经元的活动，而延髓尾端腹外侧区(cvlm)则起抑制作用。rvlm内含有丰富的阿片肽能纤维和受体。rvlm内有脑啡肽能神经元支配，这些脑啡肽能通路是从nts投射到rvlm的，该通路可能对rvlm起抑制作用。阿片类物质具有强烈的抑制心血管活动的作用，当心血管系统处于应激状态下，如心肌缺血、休克等，阿片肽释放后可通过肽能神经抑制交感神经活动〔7〕。存在于延髓心血管交感核团和心迷走神经核团的阿片受体，在中枢阿片肽的作用下，通过交感神经和副交感神经的相互作用来调控心血管系统。

实验证实，针刺抗心肌缺血作用与rvlm内多种中枢活性物质的参与有关。我们在针刺治疗心肌缺血时发现，中枢内阿片肽可能介导了这一效应，并且与下丘脑?孤束核?延髓腹外侧区神经通路有关〔8〕。纳洛酮是特异性的阿片受体拮抗剂，多年来作为工具药而广泛应用，近年也用于针刺信息的中枢通路及针刺效应中枢机制的研究〔9〕。本实验提示“双固一通”针法电针效应可能与延髓内源性阿片肽的介导有关。“双固一通”针法在改善缺血心肌功能改变时，其作用可能与电针激活其他内分泌机制或中枢递质及核团的参与有关。“双固一通”针法在抗实验性心肌缺血损伤是在多层次水平的综合作用效应，其机制可能与“双固一通”针法的整体调节作用有关。但是“双固一通”针法抗心肌缺血效应与哪些因素的参与有关，内阿片肽与它们的关系和相互作用机制如何，尚需进一步的实验研究进行深入探讨。

【参考文献】

1 刘胜中.阿片受体介导心肌缺血预适应保护作用的研究进展〔j〕.心脏杂志，2007;19(6):726?8.

2 曹建萍.近10年针灸治疗冠心病临床研究概况〔j〕.中国针灸，2001;21 (1):57?60.

3 陈东风，李伊为.内阿片肽在电针内关穴对心肌缺血影响中的作用〔j〕.上海针灸杂志，2000;19(3):36?8.

4 王 华，洪亚群，曾小玲，等.“双固一通”法对老年实验性心肌缺血模型大鼠心电图的影响〔j〕.上海针灸杂志，2003;22(9):11?3.

5 吴红金，郭 欢，谢 芳.针刺抗心肌缺血机制的实验和临床研究现状〔j〕.中西医结合心脑血管病杂志，2005;3(5):430?2.

6 吴 松，唐宏图，陈泽斌，等.“双固一通”针法对急性心肌缺血模型大鼠心肌组织过氧化物酶活性的影响〔j〕.湖北中医杂志，2006;28(10):3?5.

7 miki t,cohen m.opioid receptor contributes to ischemic preconditioning through protein kinase c activation in rabbits〔j〕.mol cell biochem,1998;186(1):3?7.

8 王 华，涂 乾,王亚文,等.电针内关穴抗家兔心肌缺血损伤下丘脑室旁核内阿片肽的作用〔j〕.中国针灸，2005;25(1):720?2.

9 dong mc,lin ls,stephanie tjen?a?lool.naloxone reverses inhibitory effect of electroacupuncture on sympathetic cardiovascular reflex responses〔j〕.am j physiol，1999;276:2127?31.