小鼠LIGHT胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

【摘 要】目的：PCR扩增小鼠LIGHT胞外段基因（LIGHTECD），构建含LIGHTECD的原核表达载体，诱导表达重组蛋白，并免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。方法：提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总mRNA，RT-PCR技术扩增LIGHTECD，克隆至原核表达质粒pGEX-6P-2中，构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECD。重组质粒进行PCR和基因测序鉴定后，转化大肠杆菌XL-1 Blue，IPTG诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果：RT-PCR扩增得到525 bp LIGHTECD目的片段；经PCR和测序鉴定，证明构建的重组质粒中插入的片段为LIGHTECD基因，测序结果经BLAST分析，与Genbank上登录序列完全一致；经IPTG诱导，重组质粒表达一相对分子量（Mr）约为45kD的目的蛋白条带。ELISA 检测免疫兔血清效价为1∶20 000。结论：成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因，并表达了相应可溶性蛋白，准备了高效价的兔抗LIGHTECD多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。

【关键词】LIGHT；原核表达；免疫原性；多克隆抗体

LIGHT （lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for herpesvirus entry on T cells）最早是Mauri等[1]在对单纯疱疹病毒入侵活化T细胞的研究中发现的，是肿瘤坏死因子超家族的第14个成员，又名HVEM-L （Herpesvirus entry mdeiator-Ligand）或TNFSF14，是一种非CD28依赖的协同刺激分子。LIGHT是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，多以三聚体形式表达于活化的T细胞、未成熟DC、单核细胞、脾细胞及粒细胞膜上，也可以分泌型形式存在[2]。目前已经证实TNFSF14可以与3 种膜结合型的TNF受体家族成员结合，即TNFRSF14、LTβR （ lymphotoxinβ receptor）和DcR3，启动不同的生物学效应。现有研究已发现，TNFSF14信号通路通过刺激T细胞增殖、分化和诱导靶细胞凋亡，在抗肿瘤免疫、诱导自身免疫病和移植排斥反应、调节神经触突的发育和脂代谢及抗感染免疫中发挥重要功能[3-9]。

LIGHT作为一个多功能多效应分子，具有共刺激和细胞毒等活性，克隆LIGHT基因并获得其重组蛋白对研究该蛋白的生物学功能具有重要作用。而LIGHT胞外段基因（LIGHTECD）是其与相应受体结合，从而发挥作用的关键部位，因此本实验拟克隆LIGHTECD，构建原核表达载体，表达可溶性蛋白，并制备多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、质粒及主要试剂

4～6w雄性C57BL/6小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。E.coli XL-1 Blue及原核表达质粒pGEX-6p-2均由本研究所保存。rmIL-4（cat#404- ML）、rmGM-CSF（cat#415- ML） 购自R&D公司。DNA胶回收纯化试剂盒、小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶（BamHⅠ，NotⅠ）均购自TaKaRa公司。细胞总mRNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司

1.2 树突状细胞总mRNA的提取及cDNA的合成

收集小鼠骨髓来源的树突状细胞，体外用rmIL-4和rmGM-CSF刺激，诱导分化为未成熟树突状细胞。离心收集细胞，用细胞总mRNA提取试剂盒按说明书操作提取细胞总mRNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度后保存。按RT-PCR试剂盒介绍的方法反转录成cDNA。

1.3 小鼠LIGHT胞外段基因的扩增

根据Pubmed数据库小鼠LIGHT基因序列，对照pGEX-6p-2载体上的多克隆酶切位点，设计LIGHTECD的特异性扩增引物。上游引物为：5′-CGGGATCCATAGTAGCTCATCTGCCAGA-3′，下划线序列为BamHⅠ酶切位点，下游引物为：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCG-3′，下划线序列为NotⅠ酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增LIGHTECD。扩增条件为：预变性94℃ 3min后，进入变性94℃ 30s ，退火58℃ 30s，延伸72℃ 45s的循环，共计35次，末次循环后补延72℃ 10min，终止反应。经电泳鉴定后，用DNA胶回收纯化试剂盒纯化PCR产物。

1.4 小鼠LIGHT胞外段基因的克隆及鉴定

纯化的LIGHTECD PCR扩增产物和pGEX-6p-2空质粒经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后，用T4 DNA Ligase 连接，转化至E.coli XL-1 Blue感受态细胞中，用含氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜，筛选阳性克隆并用PCR初步鉴定。挑取PCR初筛阳性的单个菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，提取质粒送往北京赛诺基因组研究中心测序，序列正确的重组质粒命名为pGEX-6p-2-LIGHTECD。

1.5 小鼠LIGHT蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

挑取经测序鉴定的阳性菌落到LB液体培养基（含有100 μg/ml 氨苄青霉素）中，37℃ 培养16～18h。按1∶100比例接种于400 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB 培养基中后，37℃ 培养至A600 nm达0.8。加入IPTG（终浓度为200 μmol/L），22℃ 振荡培养5 h，同时设不加IPTG组作为对照。6000 r/min 离心收集细菌，将细菌沉淀重悬于20 ml 含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，超声。4℃，15000 r/min 离心15 min，收集上清，分装，保存于-80 ℃备用。取1 ml上清液，加20 μl PBS 洗涤过的谷胱苷肽琼脂糖珠4B，室温旋转孵育1 h，离心收集谷胱苷肽琼脂糖珠， 用0.25% PBST洗涤2次，再用PBS洗涤1次后，得到纯化的融合蛋白。经12% SDS-PAGE 凝胶电泳，Coomassie blue染色，鉴定融合蛋白的表达情况。

用该重组蛋白免疫新西兰兔制备免疫血清，ELISA测定特异性抗体滴度达1∶20 000，说明该蛋白具有较强的免疫原性。Western Blot 结果显示该原核表达的融合蛋白能与相应的抗体特异性结合。

本研究成功构建了重组质粒pGEX-6p-2-LIGHTECD，并得到相应的可溶性蛋白和兔免疫血清，为下一步的功能研究奠定了基础。

参考文献：

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