促甲状腺素受体膜外区(hTSHR?ECD)在大肠杆菌中的表达和纯化

【摘要】 目的 用大肠杆菌表达重组人促甲状腺素受体膜外区(htshr?ecd)蛋白，为htshr膜外区的研究提供工具。方法 从人甲状腺组织中提取总rna，rt?pcr分离得到tshr膜外区cdna，双酶切后插入原核表达载体prset c中, 进行序列分析;再转化到表达菌bl21中表达、 纯化、western blotting 分析。结果 经sds?page电泳有一条明显的蛋白带,与预期分子量相符,并用western blot证实; 纯化后,获得单一条带的靶蛋白。结论 成功获得高纯度人tshr膜外区蛋白。

【关键词】 人tshr膜外区；rt?pcr; 蛋白质纯化

abstract:objective to express and purify human thyrotropin receptor ectodomain （htshr?ecd） for further functional study.methods total rna was isolated from human thyroid, htshr?ecd cdna was obtained with rt?pcr technique, subcloned into the plasmid prset c，and expressed in a soluble form in e. coli bl21.results there was an obvious band in sds?page electrophoresis, whose molecular weight was equal to that we designed. western blot proved the expressed product was htshr?ecd protein.conclusion high pure target protein,htshr?ecd,was obtained.

key words:human tshr?ecd; rt?pcr; purify protein

促甲状腺激素（thyroid?stimulating hormone, tsh）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，主要作用的靶器官是甲状腺，它与甲状腺细胞膜上特异的受体即促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor, tshr)结合后，提高甲状腺的摄碘能力，并促进甲状腺激素的合成和释放，对甲状腺组织的生长、分化等起着非常重要的作用。在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, aitd)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor, tshr)是重要的自身抗原［1］，机体产生针对tshr的自身抗体(thyrotropin receptor antibody, trab)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的tshr数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展tshr的进一步研究。本研究从人甲状腺中提取rna，通过逆转录获得tshr膜外区cdna，构建原核表达载体，成功表达和纯化高纯度人tshr膜外区蛋白。

1 材料与方法

1.1 组织来源和实验材料

甲状腺组织来源于已确诊的graves手术患者。大肠杆菌dh5α和bl21购于北京鼎国生物技术有限公司;限制性内切酶ecorⅰ、xhoⅰ、t4 dna连接酶及t克隆载体试剂盒pmd18?t系日本takara产品;原核表达载体prsetc和ni2+?nta悬液系美国invitrogen公司产品; total rna isolation system、access rt?pcr system、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg和发光试剂盒为promega公司产品;兔抗tshr是上海亚培生物科技有限公司产品;质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。

1.2 pcr引物的设计合成

根据 文献 报告人促甲状腺激素受体cdna 序列资料［2］，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增 htshr 膜外区cdna 编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′?caactcgag accatgctgggcggaatggggtgttcg?3′，它包涵有转录启动子、kozak系列和xho ⅰ酶切位点;下游引物为5′?tacgaattcctacaggaacttgtagcccat tat?3′, 它包涵有转录终止子和ecor ⅰ酶切位点。

1.3 总rna的提取和rt?pcr

冻存的约100 mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿?异丙醇，抽提组织中的总rna，经乙醇漂洗后溶于无rna酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定rna的a260和a280值。rna样品预处理于75 ℃变性5 min后速放冰上冷却。rt?pcr反应体系：amv反转录酶(5 u/μl)1 μl， dna聚合酶(5 u/μl)1 μl，5×amv/ buffer 10 μl，上下游引物各3 μl，最后混合rna样品加无rna酶灭菌去离子水至50 μl。混匀后置pcr仪上，逆转录反应条件设为：48 ℃逆转录60 min，94 ℃预变性2 min。pcr反应条件为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，68 ℃延伸270 s，45个循环后，68 ℃终延伸10 min。对rt?pcr产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。

1.4 克隆质粒和原核表达载体的构建及鉴定

促甲状腺素受体膜外区(htshr?ecd)在大肠杆菌中的表达和纯化根据ta克隆原理［3］,将tshr膜外区片段插入pmd18?t克隆载体。将tshr膜外区(thyrotropin receptor ectodomain, tshr?ecd)片段3 μl(约75 ng dna)，ta克隆载体1 μl(约50 ng dna)，t4 dna连接酶0.5 μl，10×连接酶缓冲液5 μl，加去离子水至10 μl，至pcr仪上16 ℃过夜。将连接产物转入dh5α细菌，经igtp/xgal平皿(amp+)筛选，挑选单个阳性菌落，放入10 ml lb培养液中，37 ℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。将提纯的pmd18?t? etshr重组质粒双酶切后，定向插入质粒。反应体系为pmd18?t?tshr?ecd重组质粒5 μl，10× buffer 2 μl，xho ⅰ和ecorⅰ各1 μl，加水至10 μl。将酶切体系37 ℃过夜，65 ℃ 15 min灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段etshr，提纯浓缩后加入原核表达载体prsetc(ecor ⅰ、xho ⅰ双酶切)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(amp+)，挑选阳性克隆，ecor ⅰ、xho ⅰ酶切鉴定分析后，送上海华诺生物科技公司测序。测序正确质粒命名为prsetc?tshr?ecd。

1.5 tshr?ecd融合蛋白的诱导表达

将重组质粒prsetc?tshr?ecd转化感受态细菌bl21，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取单个菌落，接种于5 ml lb培养基中（含氨苄青霉素），于37 ℃摇床过夜。次日，按1∶100转种于500 ml lb培养基中，37 ℃振荡培养至对数生长期，加入iptg至终浓度1 mmol/l, 32 ℃诱导振荡培养4 h,离心收集菌体，sds?page分析重组蛋白的表达。

1.6 融合蛋白的纯化

将1 ml ni2+?nta悬液和4 ml细菌裂解上清液轻轻混匀，4 ℃放置60 min，直接过柱，过柱结束后，用4 ml漂洗液（20 mmol/l咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l磷酸二氢钠ph8.0）,洗脱未和ni2+结合的杂蛋白，经过2次漂洗后，再用0.5 ml洗脱液（250 mmol/l咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l磷酸二氢钠ph8.0）3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集，取收集液，进行sds?page分析。

1.7 融合蛋白western blot 检测

取细菌裂解上清液加等量2×sds上样缓冲液在sds?page凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，以兔抗tshr（1∶5 000）为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg(1∶500)为二抗进行抗原抗体反应，发光试剂盒显色。

2 结 果

2.1 tshr膜外区基因片段的扩增

从graves手术患者甲状腺组织提取总rna并反转录成cdna,利用合成的特异引物进行rt?pcr扩增，得到约1 232 bp扩增产物，与目的基因大小相符。

2.2 重组表达质粒prsetc?tshr?ecd的鉴定

将所得tshr膜外区基因片段克隆入表达载体prsetc中， 构建好的质粒经双酶切鉴定， 可见约1 224 bp基因片段，见图1。测序结果与genbank中tshr膜外区基因序比较，两者完全一致，表明重组表达质粒prsetc?tshr?ecd构建成功。

2.3 tshr膜外区蛋白的表达及纯化

经过条件的摸索，在a600约0.6～0.8，iptg浓度为1 mmol/l, 32 ℃诱导振荡培养4 h时，蛋白得到了大量可溶表达，经过sds?page分析见相对分子量约为 47 kd的蛋白带，tshr膜外区蛋白经过ni2+?nta亲合层析纯化，得到单一条带的靶蛋白，与预期分子量相符，见图2。

2.4 融合蛋白的western blot结果

显色后，约为 47 kd处出现条带，与预期的所要表达的6×his融合tshr?ecd蛋白大小相符，表明目的蛋白在大肠杆菌中得到有效表达，见图3。

3 讨 论

人促甲状腺素受体(htshr)是一种膜蛋白，主要存在于甲状腺滤泡细胞(tec)膜上。生理情况下，htshr与促甲状腺素(tsh)结合，调节甲状腺滤泡细胞的正常功能和生长。htshr为g蛋白偶联的大分子糖蛋白，分为膜外区、跨膜区和膜内区3部分, 膜外区非常大，由397个氨基酸残基组成;由于不明原因，tshr膜外区容易发生裂解和脱落而进入血流，触发和增强了tshr的自身免疫，引起甲状腺功能亢进的发生［4］。国外学者用体外重组得到的tshr膜外区纯化蛋白，可成功诱导甲亢模型［5］。因此,对该蛋白功能的研究具有重要的理论意义; 在国内，有 文献 提及原核表达载体的构建和蛋白的表达［6，7］。

本实验采用了原核表达载体prsetc, 该载体有2个特点:一是含有t7启动子, 可被t7 rna聚合酶识别, t7 rna聚合酶转录效率比大肠杆菌rna聚合酶高5倍,能够高效转录mrna, 大量表达目的蛋白。二是载体上仅携带有6个his残基,对目的蛋白的结构和生物学影响很小,而且便于纯化。本研究成功构建tshr膜外区原核表达质粒, 以可溶蛋白形式获得较高表达, 通过ni2+?nta柱纯化,获得纯化的目标融合蛋白质,为研究graves′甲亢的发病机制,探索新的诊断方法及免疫学 治疗 提供新的工具。

【 参考 文献】

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［3］萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南 ［m］. 3 版. 北京：北京 科学 出版社, 2002:960-961.

［4］chen c r, pichurin p, nagayama y, et al. the thyrotropin receptor autoantigen in graves disease is the culprit as well as the victim［j］. j clin invest, 2003,111(12):1897-1904.

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［7］武敏，施秉银，伍丽萍，等.人tshr膜外区cdna克隆及真核表达载体构建［j］.西安 交通 大学学报: 医学版，2007，28（2）：123-125.