青藏高原甘西鼠尾草内生放线菌抗性菌株筛选

[摘要]采用平板涂布法从青藏高原药用植物甘西鼠尾草Salvia przewalskii中分离内生放线菌24株，以西瓜镰刀病菌Fusarium moniliforme、玉米大斑病菌Helminthosporium turcicum和玉米小斑病菌Bipolaris maydis为靶标菌，采用平板对峙法研究了甘西鼠尾草内生放线菌的抑菌活性。结果显示，共21株内生放线菌对3种靶标菌表现了不同程度的抑菌活性，占分离总数的85.7%。有4株内生放线菌同时对3种靶标菌表现出较明显的抑菌活性。表型鉴定结合16S rDNA系统发育分析初步确定菌株的分类地位全部为链霉菌。表明甘西鼠尾草内生放线菌作为一类新的微生物资源具有很好的开发潜力。

[关键词]甘西鼠尾草；内生放线菌；抗性菌株；分离；筛选

鼠尾草属Salvia Linn是唇形科Lamiaceae鼠尾草族Salvieae中最大的一个属，全世界约有1 050种，主要分布在亚热带、热带、温带地区，在我国西南地区最多[1]。鼠尾草具有清热利湿、活血调经、解毒消肿等功效，化学成分主要为酚性化合物和萜类化合物[2]，70多个化合物为天然植物中首次发现，二萜类化合物占90%以上，其二萜醌类又占50%以上[3]。目前，药用植物药效成分生产主要依赖植物体本身，但含量少，提取不足，故研究其化合物的新来源显得尤为重要。放线菌是产生生物活性物质最多的微生物[4]，产生的生物活性物质超过11 000种，占已发现微生物药物的2/3[5-6]。当前在普通环境中发现新的放线菌和新的活性物质显得极为困难。近年来，一些实验室开始转向植物内生放线菌资源的挖掘，以期从中获得新的生物活性物质[7]。植物内生放线菌是植物微生态系统的天然组成部分，是一个生态学概念[8]，虽经历了几十年的研究，但对其知之甚少。鼠尾草内生放线菌有哪些？与鼠尾草如何协同进化？能否产生与鼠尾草相关的药效成分均未见报道。本研究以青藏高原甘西鼠尾草为材料，依据内生放线菌为适应特殊环境极可能有特殊代谢机制为假设，以农作物病原真菌为靶标，筛选出具有抗菌活性的菌株，以期挖掘具有新次生代谢产物的内生放线菌资源，通过形态特征和系统发育分析确定其初步分类地位，为进一步开发新的抗菌药物奠定基础。

1材料

1.1样品采集与处理 甘西鼠尾草采自青藏高原东部的老榆林乡（海拔3 080 m），直接带土采集，封口，放于冰盒内低温保存。有伤口的地方及时用乙醇擦拭消毒，接种前保存在4 ℃冰箱中。

1.2分离培养基准备 以S培养基[9]、腐殖酸培养基[10]、改良高氏2号培养基[11]和海藻糖-脯氨酸培养基[11]作为内生放线菌的分离培养基，并以不同的抑制剂组合加入分离培养基来抑制杂菌的生长。抑制剂采用以下组合：100 mg·L-1放线菌酮+50 mg·L-1重铬酸钾或者20 mg·L-1萘啶酮酸+50 mg·L-1重铬酸钾[12-13]。

1.3样品消毒 将采集的甘西鼠尾草植株根、茎、叶用流水冲掉植物表面的泥沙杂质，在室内晾干，然后把植物样品剪切成小段，浸泡在75%乙醇中5 min，用无菌水冲洗，再把样品浸泡在有效氯浓度为1%次氯酸钠溶液中[含1～2滴聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）]，20 min，用无菌水冲洗，样品浸泡于灭过菌的10% NaHCO3溶液中10 min（使成中偏碱性，利于放线菌生长），用无菌水冲洗，最后干燥备用。

1.4仪器设备 PCR仪：K960，杭州晶格科学仪器有限公司生产；凝胶成像系统：JY-04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司生产。

2方法

2.1内生放线菌的分离纯化 取约5 g表面消毒的植物组织，用无菌剪刀剪成小块，加入10 mL无菌水后置于研钵中充分研磨，取匀浆液涂布于分离培养基平板上，28 ℃避光培养。每隔7 d从分离培养基上挑菌，直到30 d后结束；高氏2号培养基纯化。

2.2抗性菌株筛选 筛选出的内生放线菌采用平板对峙法[14]对常见的西瓜镰刀病菌Fusarium moniliforme Sheld、玉米大斑病菌Helminthosporium turcicum Pass和玉米小斑病菌Bipolaris maydis 3种常见植物病原真菌进行抑菌效果检验，放置于28 ℃培养下5～7 d，观察是否产生抑菌圈，测量抑菌圈直径，重复3次，取抑菌圈直径的平均值。

2.3表型鉴定 筛选出的抗性菌株根据菌落形态，菌丝及孢子显微特征进行初步鉴定。取分离到的菌株用高氏2号琼脂埋片培养，28 ℃培养7～28 d，取埋片，用光学显微镜观察基内菌丝的发育情况、气生菌丝、孢子丝及孢子等的形态特征[15]。

2.416S rDNA系统发育分析 选用Biomiga公司的试剂盒提取放线菌基因组DNA，选用27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA。PCR反应体系为50 μL，包括：2×PCR Mix 25 μL，27f（10 μmol·L-1）1.0 μL，1492r（10 μmol·L-1）1.0 μL，DNA模板（50 μg·L-1）2.0 μL，ddH2O加至50 μL。按上述组分配制反应体系，分装于200 μL PCR管中，充分混匀后进行PCR反应。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃最终延伸7 min。

PCR产物的检测：16S rDNA扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶（含EB）电泳检测。分别将3 μL PCR产物与1 μL 0.25%溴酚蓝混合点样，100 V电泳30 min。凝胶成像系统下观察，检测扩增片段的长度和浓度。将扩增产物送上海快基生物科技有限公司测序。将获得的16S rDNA序列与GenBank中的已知序列进行比对，找到待测16S rDNA的高度同源序列及其相关信息。用ClustalX 1.81进行多序列比对，进化距离用PHYLP软件包中的DNADIST程序计算，系统发育进化树用MEGA5.1的Neighbor-joining法[16]构建。

3结果与分析

3.1甘西鼠尾草内生放线菌分离情况 用4种分离培养基共从甘西鼠尾草分离获得内生放线菌24株。其中改良高氏2号培养基分离效果最佳，共获得10株放线菌；其次是腐殖酸培养基，共分离到6株放线菌；S培养基和海藻糖-脯氨酸培养基分离效果最差，分别只分离到4株放线菌。另外，从甘西鼠尾草根、茎、叶分离获得的内生放线菌数量也存在差异，茎中分离得到的内生放线菌最多（12株），根和叶分离到的放线菌相当，均为6株。

3.2抗性菌株的筛选 24株放线菌中有21株具有抗菌活性，其中分离自鼠尾草的根（S1204）和茎（S1206，S1207，S1209）中的4株放线菌对3种植物病原真菌均有抑制作用；其次S1202，S1203，S1214，S1215，S1216，S1211，S1212，S1221对西瓜镰刀病菌，玉米小斑病菌和玉米大斑病菌中的2种有抑制作用，S1220只对西瓜镰刀病菌有抑制作用，S1219只对玉米小斑病菌有抑制作用，S1201，S1208，S1210，S1213，S1217，S1223，S1224只对玉米大斑病菌有抑制作用，S1205，S1218，S1222对3种植物病原真菌均无抑制作用（表1）。

3.3表型鉴定 大部分内生放线菌紧贴培养基生长，菌丝结构致密，表面呈粉状或绒状，产生各种颜素。通过光学显微镜观察，基内菌丝和气生菌丝发达，基内菌多分枝、无横隔，气生菌丝产生孢子链，多数呈柔曲状，部分呈螺旋状或直链。根据《放线菌的分类与鉴定》描述[15]，均初步判断为链霉菌Streptomyces（表2）。

3.4内生放线菌系统发育分析 选取4株具有广谱抗菌高活性的菌株S1204，S1206，S1207，S1209进行16S rDNA核苷酸序列分析，扩增片段长度为1.5 kb左右。通过BLAST比对，挑取与GenBank数据库中同源性高的16S rDNA序列构建系统发育树（图1）。在这个发育树中，菌株S1206与Streptomyces djakartensis，S1204与S. rubrocyanodiasticus分别聚在一起，相似度最高；S1207，S1209与S. albidoflavus均在一个分支上，亲缘关系最相近。根据同源性判定其种属地位，进一步证明上述4株抗性菌株均为链霉菌。

4讨论

药用植物与自身内生放线菌常常具有相同或相似的次生代谢产物合成途径[17-18]，有的内生放线菌产生相同或相似的活性物质，在长期协同进化过程中，宿主植物同内生放线菌相互影响，能使有的内生放线菌产生结构新颖、功能特殊的次生代谢产物，成为发现天然活性产物的重要来源，也是发现新化合物和新药物的潜在资源，对克服药用植物资源生产周期长、野生资源匮乏等矛盾，利用药用植物内生放线菌工业发酵生产中药天然药物提供了新的思路，保护了濒危野生药用植物资源，在农业和医药业中具有重要的应用前景[19]。

本研究选择青藏高原甘西鼠尾草作为实验对象，内生放线菌在长期适应特殊生长环境过程中有可能形成独特的生理机制和遗传基因，从中较容易分离得到特殊的代谢产物和具有开发潜力的菌株。内生放线菌的生长，选择性分离培养基的设计极为重要。减少培养基中有机物的含量，使用贫营养的培养基可以有效的抑制内生真菌和细菌的生长。同时在培养基中添加适量的抑制剂也可较好的抑制细菌和真菌的生长。

采用不同的培养基分离甘西鼠尾草内生放线菌，均发现茎中分离到的放线菌数量最多，这与之前有报道内生放线菌很大一部分源于根和叶不同[20]，也许与不同植物分离内生放线菌有关，说明植物内生放线菌与植物之间的共生关系是有序的，有选择性的。其次，在甘西鼠尾草中分离到的内生放线菌种群不是很丰富，只有链霉菌属，没有其他属，与甘西鼠尾草实际存在的放线菌相比，可能还有大部分未分离得到，这也许和采用的分离方法有关，因此，后续我们将尝试再设计和使用多种培养基和培养条件，以便尽可能多的分离目的菌株。

把分离到的24株内生放线菌通过对3种靶标植物病原真菌检测其抗菌活性，21株放线菌至少对1种靶标菌有抑菌活性，占总分离到内生放线菌的87.5%，表明甘西鼠尾草内生放线菌具有较高的开发价值。特别是S1204，S1206，S1207，S1209菌株，对3种靶标菌都表现出不同程度的抑菌活性，且抑菌活性稳定，显示了较强的广谱抗性，可能具有很好的生物防治潜力，有助于筛选新颖抗生素及活性物质，为人类发现具有药用价值的新化合物提供了一个尚未开发的新资源[21]。关于这些内生放线菌产生的抗菌活性物质是否与甘西鼠尾草的酚性化合物和萜类化合物有关及分离提纯和结构鉴定等都尚待进一步研究。

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Screening of antifungi endophytic actinomyces strains from

Salvia przewalskii in Tibean Plateau

LIU Song-qing1，2， JIANG Hua-ming1，3， GUAN Tong-wei4， QI Shan-shan1， GU Yun-fu1，

ZHAO Ke1， WANG Xu1， ZHANG Xiao-ping1*

（1. College of Resource and Environment， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China；

2. Sichuan Fisheries School， Chengdu 611730， China； 3. Sichuan Vocational and Technical College， Suining 629000， China；

4. School of Bioengineering， Xihua University， Chengdu 610039， China）

[Abstract] Twenty-four endophytic actinomycetes strains were isolated from the Salvia przewalskii in Tibetan Plateau of China by tablet coating method. Fusarium moniliforme， Helminthosporium turcicum and Bipolaris maydis were selected as indicator fungi to test the antimicrobial activities of these endophytic actinomycetes by tablet confrontation method. The results showed that 21 strains can produce antimicrobial substances which accounts for 85.7% of the total separates number. Four strains of endogenous actinomyces have more obvious antifungi activity. According to results of morphology and culture properties and 16S rDNA sequences of endophytic actinomyces， it is concluded that all of the isolates were streptomycetes trains.

[Key words] Salvia przewalskii； endophytic actinomyces； antifungi strain； isolation； screening

doi：10.4268/cjcmm20131907