白花檵木促大鼠皮肤伤口愈合物质基础初步研究

[摘要] 目的：观察白花檵木粗提物（extract of Loropetalum chinens，ELC）促大鼠皮肤伤口愈合作用，并对粗提物分离提取得到的组分进行促愈合药理筛选，为白花檵木促皮肤愈合物质基础研究奠定工作基础。方法：应用酶解和溶剂萃取手段制备白花檵木粗提物，进而以有机溶剂对粗提物萃取，获得多种分离组分；采用大鼠皮肤割伤模型（incision wound model）和切除伤模型（excision wound model）2种国际常用体内模型研究白花檵木粗提物及分离组分的促愈合作用，对伤口进行愈合病理和免疫组织化学染色观察；对白花檵木粗提物进行初步分离，并采用大鼠皮肤割伤模型对分离提取产物进行促愈合作用筛选。结果：白花檵木粗提物可显著促进大鼠皮肤伤口的愈合速度，缩短愈合时间，增加愈合后皮肤抗拉强度，促进伤口处细胞及血管新生；白花檵木粗提物的初步分离提取组分中，石油醚层，乙酸乙酯层和正丁醇层促皮肤愈合作用较强，提示白花檵木的促愈合作用物质极性较小。结论：白花檵木粗提物具有显著促愈合作用，石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层3种分离组分促愈合作用较强，推测白花檵木促愈合功效活性物质极性较小。

[关键词] 白花檵木；伤口愈合；割伤模型；切除伤模型

白花檵木是金缕梅科Hamamelidaceae檵木属的常青灌木植物，分布于赣湘亚热带地区，具有重要的药用价值。白花檵木始载于《植物名实图考》，具有“愈合止血、涩肠止泻、生肌、消炎、镇痛”之功效，应用于治疗创伤出血。与白花檵木同种属的北美金缕梅也广泛应用于烧伤等皮肤疾病的治疗。檵木的提取部位主要包含单宁类和多酚成分，植物中的多酚成分已被证实具良好的促伤口愈合功效。根据白花檵木的历史记载、民间用药习惯均显示白花檵木止血愈合、促进伤口愈合效果显著，但是缺乏科学的实验验证，促愈合功效物质基础和作用机制也未见报道[1-3]。本文以白花檵木粗提物及其初步分离产物为研究对象，以大鼠皮肤割伤和切除伤作为研究模型研究白花檵木的促愈合功效，为白花檵木促皮肤愈合物质基础研究奠定工作基础。

1 材料

1.1 动物 Wistar大鼠，雄性，150～200 g，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心，许可证号SCXK（京）2009-0017。

1.2 药物与试剂 白花檵木粗提物，棕褐色粉末，由江西德宇集团提供（批号20090312）；呋喃西林原料药购自枫柃实验用品专卖店；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；CD34 mouse antibody购自美国GeneTex公司；Go a Mo IgG/HRP购自北京中杉金桥生物技术有限公司；戊巴比妥、DAB显色液购自美国Sigma公司；海藻酸钠、甲醇、甲酸等试剂均购自国药集团化学试剂公司。

1.3 仪器 小动物麻醉机（美国Matrix），数码相机（日本OLYMPUS），FB-20拉力计（苏州伟创精密仪器有限公司），石蜡切片机（美国AO），正置显微镜（日本NIKON）。

2 方法

2.1 白花檵木粗提物及分离组分提取物制备 将白檵木鲜材料破碎，采用酶解获得白檵木破壁产物，采用温浸法提取16 h，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，得到白花檵木粗提物（extract of Loropetalum chinens，ELC），质量为生药量的5.5%～6%。将白花檵木粗提物按照如下步骤进行组分分离提取：白花檵木粗提物粉末481.3 g（约含生药量8 kg），95%乙醇提取2次，溶剂用量分别为3 600，3 000 mL，提取时间均为1 h，得提取物170 g（1号），得率35.3%；然后剩余残渣继续用80%乙醇提取1次，溶剂用量3 000 mL，提取时间1 h，得到提取物90 g（6号）。将1号样品留样9.8 g，其余进行水分散，以不同溶剂萃取，得到组分提取物：石油醚层1.038 g（2号），乙酸乙酯层33.4 g（3号），正丁醇层45.829 g（4号），水层88.3 g（5号）；将6号样品留样9.9 g，其余进行水分散，以不同溶剂萃取，得到组分提取物：乙酸乙酯层6.272 g（7号），正丁醇层13.125 g（8号），水层64 g（9号）。

2.2 试剂配制 2%海藻酸钠：称取20 g海藻酸钠，分次加入1 000 mL蒸馏水中并加热，待其溶胀后搅拌至全溶； 1%呋喃西林：称取0.5 g呋喃西林溶于50 mL的2%海藻酸钠中，充分搅拌，每隔4 d重新配制；1%白花檵木受试物：称取0.5 g受试物（如白花檵木粗提物，1号组分、2号组分等）溶于50 mL的2%海藻酸钠中，充分搅拌，每隔4 d重新配制。

2.3 白花檵木粗提及分离组分促大鼠皮肤割伤模型愈合作用评价 ①15只大鼠，随机分成3组，分别为空白组、呋喃西林组、白花檵木组，每只大鼠单笼饲养，以防其互相撕咬伤口；②适应性饲养3 d后，3%戊巴比妥钠麻醉，背部去毛，在每只大鼠背部距中线约1.5 cm处用手术刀划开一条长6 cm的伤口，深达皮下（未损伤其筋膜层），每隔1 cm手术线缝合以防伤口裂开[4]；③术后立即对各组的伤口涂药：空白组伤口处涂2%海藻酸钠，呋喃西林对照组伤口处涂1%呋喃西林[5]，白花檵木组伤口处涂1%白花檵木，每只动物均在头部套上自制的项圈（与宠物的伊丽莎白项圈类似），以防其舔舐伤口；④每日在3%异氟烷气体麻醉状态下涂药，给药第8天拆除缝合线，连续给药第10天处死大鼠，将伤口附近1.5 cm范围的皮肤剪下，于中间处分割出伤口长1 cm的皮肤3份，用拉力计（带峰值保存）测将愈合伤口拉开所需的最小拉力，将这3份数据取平均值作为该只动物伤口的最终拉力。

选用大鼠割伤模型来筛选白花檵木的组分提取物的促愈合作用，先研究1号及6号受试组分，然后根据实验结果，对有促愈合作用的1号组分的进一步分离提取产物2，3，4，5号组分进行促愈合作用筛选。

2.4 白花檵木粗提物促大鼠皮肤切除伤模型愈合作用评价 ①15只大鼠，随机分成3组，分别为空白组、呋喃西林组、白花檵木组，每只大鼠单笼饲养，以防其互相撕咬伤口；②适应性饲养3 d后，3%戊巴比妥钠麻醉，背部去毛，在每只大鼠背部脊柱单侧稍靠上部进行约400 mm2大小的全皮肤切除（不损伤筋膜层），在伤口同一平面处放一把尺子以作为实际大小的参照物，数码相机拍摄，记录伤口初始面积大小[6]；③术后伤口处涂药：空白组伤口处涂2%海藻酸钠，呋喃西林组伤口处涂1%呋喃西林，白花檵木组伤口处涂1%白花檵木，每只动物均在头部套上自制项圈（与宠物的伊丽莎白项圈类似），以防其舔舐伤口；④每日在3%异氟烷气体麻醉状态下涂药，每隔3 d按上述方法对伤口进行拍摄以跟踪其愈合程度，直至术后15 d，坚持每天涂药直至伤口处无任何结疤残留，记录其伤口愈合天数；⑤在术后第18天将新生皮肤组织剪下，4%多聚甲醛固定，留做染色用。

2.5 皮肤组织病理及免疫组化染色 病理染色：大鼠皮肤切除伤愈合皮肤组织以4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水石蜡包埋，5 μm切片，常规HE染色，光学显微镜下观察组织病理HE染色切片，以愈合区域再生表皮完整程度，肉芽组织紧致程度和出现水肿为指标判断伤口愈合质量：0分，再生表皮不完整，肉芽组织松散，有水肿；1分，再生表皮部分完整，肉芽组织无明显水肿；2分，再生表皮完整，肉芽组织紧致，无水肿；由2个独立观察者读片。免疫组织化学染色：在组织包埋后脱水，以3%H2O2灭活，0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中煮沸修复抗原，封闭过夜，孵育抗鼠CD34一抗，4 ℃冰箱过夜后孵育生物素标记二抗，DAB显色。高倍镜（400×）下观察计数5个视野毛血管数量，对比各组切片中毛细血管数量差异。

3 结果

3.1 白花檵木粗提物促进大鼠皮肤割伤模型伤口愈合 在割伤模型中，采用伤口撕裂张力这一指标来评价白花檵木粗提物对皮肤割伤恢复的影响。结果显示，在术后第10天，空白组、呋喃西林组与白花檵木粗提物组伤口撕裂张力分别为（517.5±74.70），（678.3±68.23），（797.3±32.95） g。白花檵木粗提物组（ELC）伤口撕裂张力与空白组相比有极显著性增加，同时与呋喃西林组相比，在相同给药时间内，白花檵木粗提物显著增强伤口撕裂张力。

3.2 白花檵木粗提物促进大鼠皮肤切除伤模型伤口愈合 白花檵木粗提物可显著加速切除伤伤口愈合速度，涂药3 d后，白花檵木组伤口愈合32%，空白组伤口愈合14.5%；白花檵木粗提物处理组第15天伤口已愈合完毕，而同期空白组愈合94%。呋喃西林作为阳性对照，也表现出明显的促伤口愈合作用（表1）。

伤口处结疤完全脱落，可被认为伤口已经完全愈合，因此结疤脱落天数是伤口恢复情况的重要指标。白花檵木组在第13天时出现首只大鼠结疤完全脱落，第15天时该组大鼠伤口结痂全部脱落完毕；呋喃西林组在第14天时出现首只大鼠结疤完全脱落，到第16天时全部脱落完毕；空白组伤口愈合显著滞后，在第17天时出现第一只大鼠伤口结疤完全脱落，到第20天该组大鼠结疤脱落完毕，表明白花檵木和呋喃西林能显著加速伤口愈合速度（图1）。

将每日记录伤口面积与术后初始伤口面积相比的百分率为指标，空白组、呋喃西林组和白花檵木组手术造成初始伤口面积无显著差异，随着涂药的时间延长，各组的伤口恢复情况出现了明显差异：第8天时，呋喃西林组和白花檵木组伤口面积与空白组相比已有明显缩小，在第15天时，白花檵木组伤口已完全愈合，而空白组伤口愈合约90%。

大鼠伤口新生皮肤组织HE染色结果（图2）显示，空白组新生组织细胞排列较疏松，上皮生成不完全，表明伤口没有完全愈合；白花檵木组新生组织细胞排列致密，上皮生成完全，说明组织生成比较完全，伤口愈合情况更好。

IHC染色结果（图3）显示，空白组新生皮肤的新生血管较少，而白花檵木组皮肤新生血管较多，表明其伤口恢复情况较空白组更好。

3.3 白花檵木分离提取组分促愈合作用筛选 根据分离提取方法，1号组分为白花檵木粗提物的95%乙醇提取物，2～9号组分均是在1号组分基础上提取分离而来，其中2～5号为1号组分进行水分散萃取后所得到的极性和溶解性不同的组分，在该步萃取结束后所得残渣继续提纯得到6号组分， 6号组分再一次分离萃取得到7～9号组分。采用大鼠皮肤割伤模型对分离组分进行促愈合作用筛选，由于2～5号为1号组分的提取物，7～9号组分为6号组分的提取物，故首先对1号、6号进行研究。结果显示，1号组分可明显提高大鼠伤口撕裂张力，显示出促愈合作用；6号组分也可以提高伤口撕裂张力，但效果不明显，提示促愈合有效成分并没有在提取1号组分时分离完全，仍有部分残留在6号组分中，但由于其含量很小，所以促愈合作用不强（图4）。因此，白花檵木促愈合作用成分的寻找可集中于2～5号，而7～9号不需要进行后续筛选工作。

采用大鼠皮肤割伤模型对2～5号组分进行促愈合作用筛选，结果表明，2号石油醚层，3号乙酸乙酯层以及4号正丁醇层伤口撕裂张力较空白组有明显提升，而5号水层伤口撕裂张力略有上升，但不具有显著性差异，说明促愈合作用成分极性较小，主要集中于石油醚层，乙酸乙酯层和正丁醇层，由于分离不彻底，在水层略有残余，含量不足以产生显著性差异（图5）。故后续分离提取可围绕2～4号展开。

4 讨论

皮肤创伤是一种常见的健康问题，发生率较高，如处理不当，会引起溃烂不愈等严重问题，甚至死亡。因此，寻找促进伤口愈合的药物，是药物研发领域最古老，也是最重要的挑战之一[7]。白花檵木促皮肤愈合作用，已得到数百年民间应用的验证。对白花檵木进行促皮肤愈合研究，寻找有效成分，不失为寻找皮肤创伤治疗药物的一条捷径。

本研究主要采用大鼠皮肤割伤模型和切除伤模型2种国际上常用模型研究白花檵木粗提物促皮肤愈合作用，对于割伤模型，在涂药10 d后即可测其伤口撕裂张力。伤口撕裂张力即将已部分愈合的伤口完全拉开所需的最小拉力。在伤口愈合之初，撕裂张力较小，伤口两侧只有很小的力使各自聚合在一起；此后随着胶原生成增多和胶原纤维直接交联形成增加，伤口撕裂张力迅速增加，胶原生成越多，交联越密，说明伤口恢复越好。

对于切除伤模型，伤口愈合过程伴随着肉芽组织增生及伤口面积缩小，肉芽组织中含量最多的是肌成纤维细胞，富含肌动蛋白，这些蛋白在收缩时产生机械拉力，将伤口边缘向中心牵拉，伤口面积逐渐缩小[8]。在组织重建阶段，伤口不断收缩，进而形成表面疤块组织，如果皮肤组织重建完成，疤块组织即脱落。伤口愈合速度，疤块组织脱落时间都可作为大鼠皮肤切除伤模型的评价指标。胶原纤维，上皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞在伤口修复过程中均有重要作用，伤口处血管再生能为组织修复提供营养物质，因此采用苏木素-伊红染色法和CD34新生血管免疫组化染色法观察新生组织中胶原纤维的堆积，上皮细胞、成纤维细胞的生成及血管新生情况，这些均可反映受损组织的恢复情况。

白花檵木粗提物在大鼠割伤模型实验中，涂药10 d后，伤口撕裂张力较空白组有明显增加（P

采用大鼠割伤模型对白花檵木粗提物的分离组分进行促愈合筛选，发现2（石油醚层）、3（乙酸乙酯层）、4（正丁醇层）号组分对于提升大鼠伤口撕裂张力有明显促进作用，提示白花檵木促皮肤愈合的有效成分应该分布在这3层中，而5号（水层）组分则无显著促愈合作用。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水，这四者极性由小到大，根据相似相溶原理，白花檵木中促愈合作用成分应属于极性较小的物质，可以此作为指导依据对2，3，4号组分进一步分离提取，寻找促愈合作用成分。

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Primary study of skin wound healing in rats for Loropetalum chinens

LIAN Ze-qin1， GAO Jian1， LI Xiao-bin2， LIU Hao-yuan2， ZHU Hai-bo1*

（1. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Ministry of Health Key Laboratory of

Biosynthesis of Natural Products， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100050， China； 2. Jiangxi Deyu Group， Jingdezhen 333000， China）

[Abstract] Objective： Cutaneous wound is a common health problem of humans. Loropetalum chinens， a medicinal plant， is widely used to treat wounds among the people. The research aims to observe whether L. chinens can promote the rats′ wounds healing process， isolate the extracts primarily and commit the wound healing selection， which provide work basis for wound healing research of L. chinens. Method： First we analyzed the possible components with HC-MS/MS， then committed our wound healing experiments for L. chinens in the rat incision wound model and excision wound model， which are commonly used worldwide. After that， we carried on the preliminary isolation of the L. chinens and we screened the heal-promoting effects of the isolations in incision wound model. Result： L. chinens significantly accelerates the wound healing of rat′ s skin， shortens the healing period， enhances the healing intensity and promotes the cell proliferation and blood vessels formation around the wounds. The isolations， which are petroleum ether layer， ethyl acetate layer and n-butyl alcohol layer， exert heal-promoting effects. It indicates that the possible morphon that promotes wound healing may exist in these three components， with small polar. Conclusions： L. chinens possesses strong wound healing promoting effects， and the active constituent， with small polar， exists in petroleum ether layer， ethyl acetate layer and n-butyl alcohol layer， and we should focus on these three layers when carrying on further studies.

[Key words] Loropetalum chinens； wound healing； incision wound model； excision wound model

doi：10.4268/cjcmm20132031