臭氧和负离子对镰刀菌M4抑制作用及其机理的初步研究

摘 要：为了探究臭氧和负离子对莲藕采后主要腐败菌-镰刀菌M4的生长及细胞壁、细胞膜的影响，本试验对处于稳定期的镰刀菌M4分别进行不同条件的臭氧和负离子处理，通过测定抑菌率、细胞壁和细胞膜通透性初步研究臭氧和负离子对镰刀菌M4的抑制作用及其机理。结果显示，臭氧、负离子对镰刀菌M4均有较强的抑制作用，抑菌率与处理时间成正相关；臭氧和负离子之间具有协同作用；臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞壁和细胞膜均有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加；处理前期主要是电解质的渗出，处理2 h及以上时核酸和蛋白质等大分子物质开始渗出。

关键词：镰刀菌M4；臭氧；负离子；抑菌率；细胞壁；细胞膜；通透性

中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2013）18-0098-04

镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种重要的植物病原菌，主要为害小麦、玉米、水稻、蔬菜等农作物，造成严重的减产，其生态适应性强，广泛分布于植物、土壤和水源中[1]。它属于真菌的一种，具有细胞壁和细胞膜结构。已有许多研究表明，镰刀菌是农作物生长、贮存过程中的主要为害菌种[2]。

臭氧在常温下是一种不稳定的淡蓝色气体，有特殊的刺激味。由于臭氧的强氧化性和广谱性，因而具有消毒、杀菌、除臭、防霉、保鲜等功能[4]，其杀菌能力仅次于氟，是氯的3倍，杀菌速度极快，是氯的500～3 000倍[5]。一般认为，臭氧杀灭细菌、霉菌类微生物是通过作用于细胞膜，使细胞膜构成受到损害，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，进而继续渗透破坏膜内组织，直至细胞死亡[6]。又由于臭氧使用方便、刺激性小、作用快速、无残留污染等优点，被广泛应用于食品保鲜与加工等领域[7]。

负离子是带负电的原子或基团[6]。气体放电过程中产生的负离子具有较高的活性，且有很强的氧化还原作用，能破坏细菌的细胞膜或细胞原生质活性酶的活性，在果蔬保鲜中可以起到抗菌杀菌的目的[8]。同时，负离子还可以分解内源乙烯，钝化酶活性，降低呼吸强度，从而减缓营养物质在贮藏期间的转化。

目前国内对臭氧和负离子的研究多集中于应用保鲜方面，对其抑菌机理报道较少。本试验通过测定抑菌率、细胞壁和细胞膜通透性变化，对臭氧、负离子抑制镰刀菌M4的作用及其机理做了初步探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

①菌种 镰刀菌（Fusarium oxysporum）M4由华中农业大学食品科学技术学院分离保存。

②试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）由国药集团化学试剂有限公司生产。

③仪器设备 MIC-03臭氧变送器由深圳市蓝月测控技术有限公司生产；XA-1负离子发生器、DDS-11A电导率仪由上海雷磁仪器厂生产；722N 分光光度计由上海精密科学仪器有限公司生产；J-E超速冷冻离心机由美国Beckman Coulter Inc生产。

1.2 试验方法

①抑菌率的测定 将镰刀菌在PDA培养基上培养6 d后，在菌落边缘打出直径6 mm的菌饼，移至PDA平板中央，然后将打开盖子的平板立即放入密闭有机玻璃箱中进行以下处理（温度25℃，湿度50%）：A.臭氧（3 500 mg/m3）、B.负离子（106 ions/cm3）、C.臭氧+负离子（臭氧3 500 mg/m3+106 ions/cm3），分别处理1，2，3，4 h。每个处理重复3皿，置于25℃下培养3 d，用十字交叉法测定其菌落扩展直径，并计算抑菌率。以不做任何处理的培养基为对照。用抑菌率表示其对镰刀菌M4的抑制效果。

抑菌率（%）=[（对照菌落的平均直径-处理菌落的平均直径）/对照菌落的平均直径]×100%

②对菌体细胞壁的影响 选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时不做处理的作为对照组，4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液用分光光度计于510 nm处测定吸光值[9]。

③对菌体细胞膜通透性的影响 a.对电导率的影响。选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时以不做处理组作为对照，4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液用电导率仪测定电导率，确定金属离子的渗出变化趋势[10]。

b.对大分子内含物渗出的影响。选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时以不做处理组作为对照，置于超速冷冻离心机中4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液分别于260 nm和280 nm处测定吸光值[11] 。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件对镰刀菌的抑制作用

从图1可知，在臭氧（3 500 mg/m3）、负离子（106 ions/cm3）、臭氧+负离子（臭氧3 500 mg/m3+

106 ions/cm3）3种不同处理条件下，抑菌率与处理时间均呈正相关，处理时间越长，抑菌效果越好；且臭氧+负离子处理的抑菌效果均优于臭氧、负离子单独处理，说明臭氧和负离子处理之间具有协同作用，这对于提高镰刀菌生长抑制率具有重要意义。方差分析显示，同一处理时间，3种处理间差异极显著（p

2.2 臭氧+负离子对菌体细胞壁通透性的影响

碱性磷酸酶位于细胞的细胞壁和细胞膜的间隙之中，在正常情况下不向外分泌，只有当细胞壁的通透性增大后，碱性磷酸酶才会释放到细胞体外[10]。由图2结合显著性分析可知，处理组与对照组相比，碱性磷酸酶的溶出量显著增加（p

2.3 臭氧+负离子处理对细胞膜通透性的影响

①臭氧+负离子处理对电导率的影响 由图3可知，处理组镰刀菌M4培养液的电导率显著高于对照组（p

②臭氧+负离子处理对大分子内含物渗出的影响 细胞膜的通透性是反映细胞膜完整性的一部分，当真菌细胞膜被破坏后，细胞内的小分子物质首先外泄出来，接着是大分子物质如核酸和蛋白质[2]。为进一步反映臭氧+负离子处理对细胞膜完整性的影响，可以测定渗透到细胞外的核酸和蛋白质的含量。核酸、蛋白质分别在 260 nm、280 nm 处有最大吸收峰，对260 nm和280 nm吸收物质的检测被广泛应用于测定细胞膜的完整性[12]。

由图4结合显著性分析可知，与对照组相比，臭氧+负离子处理1 h，细胞外液核酸和蛋白质的含量没有显著变化（p>0.05）；臭氧+负离子处理2 h及以上组细胞外液核酸和蛋白质的含量显著增加（p

2 h及以上组细胞外液核酸和蛋白质的含量随时间延长均有显著差异（p

综合图3和4分析可知，臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞膜有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加，处理前1 h主要导致小分子电解质渗出，致使细胞外液电导率显著增加，当处理时间延长至2 h及以上时，核酸和蛋白质等大分子物质才透过细胞膜，渗透到菌体外，处理3 h后核酸和蛋白质等大分子物质开始快速渗出。

3 结论与讨论

本试验初步研究了臭氧、负离子对镰刀菌M4的抑菌作用及其机理，结果表明臭氧、负离子对莲藕采后病原菌镰刀菌M4均有较强的抑制作用，抑菌率与处理时间呈正相关；臭氧和负离子之间具有协同作用；臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞壁和细胞膜均有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加；处理前期主要是电解质的渗出，处理2 h及以上时核酸和蛋白质等大分子物质开始渗出。可能正是臭氧+负离子处理对细胞壁和细胞膜的这种逐步破坏，导致其通透性增加，细胞内物质外流，影响菌体新陈代谢和生命活动，从而达到对镰刀菌M4的抑制效果。

参考文献

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