药理遗传学的方法指导心房颤动患者华法林使用剂量研究

[摘要] 目的 研究药理遗传学的方法指导华法林使用剂量是否优于根据临床指标确定的华法林剂量用药方法。方法 选取来自门诊或病房需要使用华法林抗凝心房颤动的患者220例，将其分为两组，一组按照药理遗传学方法确定的华法林剂量用药，采取聚合酶链反应-限制性内切核酸酶片段长度的多态性（PCR-RFLP）对患者进行CYP2C9和VKORC1基因型分析，根据计算模型确定的华法林剂量用药，并进行调整。另一组根据临床指标确定的华法林剂量用药。观察患者达标稳定时间、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例，并观察随访过程中出血事件的严重程度和发生率。随访时间约半年。 结果 药理遗传学方法指导的华法林使用剂量与根据临床指标确定的华法林剂量用药方法相比，达标稳定时间、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例（1.8%：16.4%）、严重出血事件发生率均体现出优势，差异具有统计学意义（P

[关键词] 华法林；心房颤动；CYP2C9；VKORC1

[中图分类号] R541.7+5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）32-0151-04

Dose study on atrial fibrillation patients’ warfarin use based on pharmacogenetics

FU Yongping1 ZHANG Ziyan2

1.Department of Cardiology， Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000， China； 2.Department of Hematology， Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine in Shandong Province， Heze 274035， China

[Abstract] Objective To compare the strengths of warfarin based on pharmacogenetics or defined by clinical indicators. Methods Either from outpatient or inpatient department， 220 patients who needed anticoagulative treatment by warfarin were recruited. These cases were divided into two groups. Warfarin use method of one group was determined by pharmacogenetics， specifically， CYP2C9 and VKORC1 genotyping were carried out to ascertain and adjust use dosage by Polymerase chain reaction-restriction nuclease fragment length polymorphism（PCR-RFLP）. As for the other group， therapeutic regimen was defined by the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose and the proportion of anticoagulant overdose. Additionally， the severity and incidence of hemorrhagic events were closely observed during half year’s following up. Results Compared with traditional warfarin use regimen defined by clinical indicators， the results obtained by pharmacogenetics， including the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose， the proportion of anticoagulant overdose（1.8% compared to 16.4%）， and the incidence of severe hemorrhagic events were unanimously better and statistically difference （P

[Key words] Warfarin； Atrial fibrillation； CYP2C9； VKORC1

我国心房颤动患者数接近1000万，心房颤动的主要危害是脑梗死，而脑梗死的致残率高，使患者生活质量严重下降，给患者及其家属带来巨大的精神负担和经济损失。抗凝治疗能够减少心房颤动的栓塞发生率，但由于医患双方对其出血副作用的担心，使用华法林抗凝人数很少。虽然有新型抗凝药物的出现，但新型抗凝药物价格昂贵，尚无针对性拮抗剂，在肾功能不全病人使用的局限性以及在瓣膜性心脏病应用的局限性，大规模应用新型抗凝药物并不适合我国国情。相比之下，华法林价格便宜，每日服药一次，肾功能不全患者无需调整剂量，所以华法林在抗凝治疗中的地位尚无可替代。为更好地探索我国心房颤动患者的华法林使用剂量的个体化差异，本研究以门诊或病房房颤患者为研究对象，对CHA2DS2-VASC评分≥2分以上需要华法林治疗的患者进行研究。

1对象与方法

1.1研究对象

选择2012年10月～2013年12月心内科门诊或病房需要使用华法林抗凝的心房颤动患者220例。其中男123例，女97例，年龄35～97岁，平均（57.5±12.5）岁。入选标准：（1）汉族；（2）≥18岁；（3）心房颤动患者；（4）CHA2DS2-VASC评分≥2；（5）签知情同意书并能够配合临床随访观察。排除标准：（1）严重的肝、肾功能不全或甲状腺疾病；（2）近期手术史；（3）急性心肌梗死1个月内；（4）活动性消化性溃疡；（5）感染性心内膜炎；（6）必须长期服用非甾体类抗炎药；（7）必须使用试验药物以外的抗血小板、抗凝药物及溶栓药物；（8）恶性肿瘤；（9）处于妊娠期；（10）有血液系统疾病，血小板缺乏症；（11）不能定期门诊复诊条件或治疗过程中不能规律服药；（12）拒绝随访。

1.2方法

由专人收集临床资料和随访登记，与患者签署书面知情同意书，病例随机分为两组，一组为药理遗传学组（110例）：抽取外周静脉血2 mL，提取基因组DNA，使用聚合酶链反应-限制性内切核酸酶片段长度的多态性（PCR-RFLP）给患者进行CYP2C9和VKORC1基因型分析，根据计算模型（http：//）确定的华法林剂量用药，并进行调整。另一组为临床指标组（110例）：根据临床指标确定的华法林剂量用药。华法林片由齐鲁制药有限公司生产，批准文号：国药准字：H37021314，每片2.5 mg。两组患者在性别、年龄、合并疾病病史及合并用药等一般资料方面差异无统计学意义，具有可比性，见表1。

1.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析材料与方法

1.3.1 试剂 基因组DNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、10 mmol/L dNTPs、25 mmol/L氯化镁、DNA 标记物（采购自加拿大Bio Basic Inc.）；引物由上海生工生物工程有限公司合成提供；限制性内切酶AvaⅡ、Nsi I、Msp I及琼脂糖（均购自美国Promega）。

1.3.2 仪器 HH-W21.420型电热恒温水箱（天津泰斯特仪器有限公司）；DYY-6C型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；多功能暗箱式紫外线分析装置（北京赛百奥公司）；FerroTec基因扩增仪（杭州大和公司）；LX-100手掌型离心机（江苏海门）。

1.3.3 基因组DNA提取及PCR扩增 取外周抗凝血液2 mL，使用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存。PCR反应的引物设计参考有关文献[1-3]，VKORC1基因检测的正向引物为5’-GCCAGCA-GGAGAGGGAAATA-3’，反向引物为5’-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3’；CYP2C9 *3基因检测的正向引物为5’-AATAATAATATGCACGAGGTCCAGAGATGC-3’，反向引物为5’-GATACTATGAATTTGG-GACTTC-3’；CYP2C9 *2基因检测的正向引物为5’TACAAATACAATGAAAATATCATG-3’，反向引物为5’-CTAACAACCAGACTCATAATG-3’。PCR反应体系包括基因组DNA 0.2 μg，2.5 mmol/L，dNTPs 4 mL，10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL，10 μmol/L的引物各3 mL，5 u/L Taq聚合酶0.5 μL，加超纯水至50 μL。CYP2C9*2反应条件为：先94℃预变性5 min，然后94℃处理45 s，再50℃处理45 s，最后72℃处理1 min，共35个循环，接下来72℃延伸5 min；CYP2C9*3的反应条件为：先94℃ 预变性5 min，然后94℃处理45 s，再56℃处理45 s，最后72℃处理30 s，共35个循环，接下来72℃延伸5 min；VKORC1-1639G>A的反应条件为：先94℃ 预变性5 min，然后94℃处理45 s，再59℃处理30 s，之后72℃处理30 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3.4 限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析 取用VKORCl、 CYP2C9 *2、CYP2C9 *3PCR产物各10 μL，然后分别加入限制性内切酶AvaⅡ、Msp I、 Nsi I各0.5 μL以及牛血清白蛋白0.2 μL和缓冲液2 μL，再加入超纯水至20 μL，37℃水浴4 h。酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳，最后紫外灯下观察条带。

1.4 观察指标

观察两组患者达标稳定时间（从给予首剂华法林开始到INR值在达到治疗范围（2～3）且INR值稳定所需要的时间）、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例（INR初次超过4的比例），并观察随访过程中出血事件的严重程度和发生率。随访时间约半年。

1.5统计学处理

应用SPSS 15.0统计学软件，对所有计量资料均先进行单样本正态分布检验，正态分布或近似正态分布资料的组间比较采用t检验。计量资料数据采用（x±s）表示。计数资料的组间比较采用χ2检验，P

2 结果

2.1 CYP2C9和VKORC1基因型分析

药理遗传学的方法组共对110例患者采用聚合酶链反应-限制性内切核酸酶片段长度多态性（PCR-RFLP）进行CYP2C9和VKORC1基因型分析，CYP2C9基因具有高度多态性，在基因编码区和非编码存在许多单碱基突变，最主要的有3种： CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3， CYP2C9：*1型102例占92.7%；CYP2C9：*2型0例占0%；CYP2C9：*3型8例占7.3%。VKORC1发现有AA、AG、GG三种基因型，VKORC1：AA型81例占73.6%；VKORC1：AG型26例占23.7%；VKORC1：GG型3例占2.7%.

2.2 两组临床观察指标的差异

患者随访时间半年，半年后对两组患者在达标稳定时间、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例、严重出血发生率进行观察和比较，药理遗传学的方法与临床指标组相比，各项指标均具有优势，具有统计学差异（P

表2 两组临床观察指标的差异（x±s）

注：药理遗传学组与临床指标组相比，各观察指标差异有统计学意义（P

2.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析结果

对所有抗凝过量和严重出血患者都进行CYP2C9和VKORC1基因型分析。出现抗凝过量共20例：基因类型为CYP2C9*1，VKORC1：AA共10例，有4例出现严重出血，基因类型为CYP2C9*3、VKORC1：AA共6例，有3例出现严重出血；基因类型为CYP2C9*1、VKORC1：AG共1例，基因类型为CYP2C9*3、VKORC1：AG共2例，基因类型为CYP2C9*3；VKORC1：GG共1例。10例严重出血患者的VKORC1基因型均是AA。

3 讨论

华法林在抗凝治疗中的地位尚无可替代。但华法林治疗窗很窄，而且用药的个体性差异和种族差异也很大，要达到相同作用效果，最大剂量与最小剂量相差可以达到10倍以上。目前发现影响华法林药效学的基因主要有2个，细胞色素氧化酶P450 2C9（cytochrome P-450 2C9，CYP2C9）和维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）。华法林全部由肝脏代谢，CYP2C9是人类肝脏中一种重要药物代谢酶系统，是华法林代谢最关键的酶，CYP2C9基因具有高度多态性，在基因编码区和非编码存在许多单碱基突变，其中研究最多也是最主要的有3种，即野生型CYP2C9*1、突变体CYP2C9*2和突变体CYP2C9*3，这几个等位基因的多态性可以影响华法林药效，导致个体对华法林的敏感性不同以及华法林在抗凝治疗过程中出血的危险性，对华法林的使用剂量密切相关的两个等位基因分别为CYP2C9*2和CYP2C9*3。基因型CYP2C9*2和CYP2C9*3的患者所需的华法林治疗剂量小[4，5]。VKORC1是人体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶和关键酶，华法林通过竞争性抑制此酶的作用而达到抗凝效果。VKORC1发现有AA、AG、GG三种基因型，AA基因型为华法林剂量敏感型，所需的华法林治疗剂量小。AG、GG两种基因型为华法林剂量抵抗型，所需的华法林治疗剂量大[4，5]。纳入药理遗传学的方法组的患者CYP2C9和VKORC1基因型见2.1。本研究中发现：CYP2C9基因型分布CYP2C9*1占92.7%，CYP2C9*2占0%，CYP2C9*3占7.3%。CYP2C9基因型分布以CYP2C9*1为主，与西方人相似[6-10]，可见CYP2C9基因型分布无明显种族差异。本研究中：VKORC1基因型分布AA占73.6%，AG占23.7%，GG占2.7%。与文献报道我国汉族人VKORC1基因型以AA型为主，GG、GA型少见相符[6-9]，而西方人以GG、GA型为主，AA型少见，提示VKORC1基因型存在人种差异[6-9]。已知CYP2C9*1、VKORC1-AA型基因的患者，所需华法林剂量减少，这可部分解释我国汉族人所需华法林剂量低于西方人群的原因。

本研究通过对两组间临床观察指标（表2）的比较，药理遗传学的方法组与临床指标组比较，稳定达标时间更短，药物调整的次数更少，终点剂量与初始剂量的绝对差值更小，抗凝过量的比例更低，严重出血事件发生率更低。药理遗传学的方法组各项指标均具有优势，具有统计学差异（P

本研究中观察对象共发生抗凝过量例数20例，抗凝过量患者中基因型表现以CYP2C9*3或VKORC1：AA为多见，抗凝过量患者平均年龄（72.4±9.4）岁，也较大。观察对象共发生9例严重出血，其中严重出血病人中7例抗凝过量，另外2例并未出现抗凝过量，但年龄较大，提示抗凝过量和年龄是出血的重要因素[4，11-14]。严重出血患者的VKORC1基因型均是AA，VKORC1基因型表现为AG、GG的严重出血病例没有观察到。CYP2C9*3且VKORC1：AA的患者严重出血发生率较高，应重点关注此类患者。严重出血患者平均年龄为71.5岁，高于本研究观察对象的平均年龄。药理遗传学的方法能够及早发现这些出血高危患者，避免严重出血的发生。这也是药理遗传学的方法指导华法林使用剂量组严重出血发生率低的主要原因。

基于药理遗传学的方法指导华法林使用剂量比根据临床指标确定的华法林剂量用药方法使用剂量推荐剂量更加精确，剂量调整小而少，能更快到达INR治疗范围，而且严重出血发生率低，对患者更安全，值得推广应用。

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（收稿日期：2014-07-29）