兜兰的杂交和无菌播种技术

浙江　徐刚／编译

兜兰播种很难发芽，即使发芽其发芽率也非常低，其原因是成熟种子表面附着一层发芽抑制物质。为了避免这种情况，建议采用未成熟种子进行播种。

自花授粉种、同一品种内不同株系间的杂交种、不同近缘种间的杂交种的发芽率比较好，但杂交种再进行杂交的杂交种的发芽率一般较低，特别是远缘杂交种中大部分多为不育性。这样，通过杂交和播种试验可得到充分了解。

一、花的构造和杂交方法

为了进行杂交，首先要了解花的构造。特别是通过实际的花的解剖确认花粉块(a)、柱头(b)、唇瓣(c)等的位置和形态。一旦确定要进行杂交的植株，将花粉(雄蕊)给花的柱头(雌蕊)授粉。为了杂交工作容易，最好去掉柱头一侧的唇瓣。但是为了保持花的观赏价值，授粉时，将下萼片开个孔，从背后将花粉给柱头授粉。

杂交方法非常简单：

1、用牙签等取出花粉块

2、放入柱头部的塌陷处

杂交时，作为母本的植株，开花后至少经过4～5天为好。另外，由于要经过半年多时间，种子在子房内发育成熟，希望植物十分健壮地生长，用油性记号笔或铅笔在标签牌上记上亲本名称、杂交日期等，挂在花茎上。

花粉

杂交用的花粉，是开花后至少经过1周(一般经过1～3周)时间的花粉。刚开花后的花粉，未成熟、色白、无粘着性。另一方面，利用价值高的杂交亲本的花粉可以进行冷冻(－20℃～－70℃)保存。特别是对于花期不同的亲本进行杂交是最有效的方法。在－20℃冷冻保存条件下可保存1年时间，在－70℃冷冻保存条件下可半永久性保存。在-70℃冷冻保存条件下保存了3年的花粉进行杂交取得了良好的结果。要注意保存的花粉要新鲜，若不新鲜，花粉块粘着性下降。

二、成熟时期

杂交后，子房逐渐变硬长大。采用未成熟(未开裂)种子播种时以杂交后6～8个月后的种子为好。这时的子房还未着色。随着进一步成熟(10个月左右)子房先端开始变褐，然后子房开裂，种子向四周飞散。采用完熟(开裂)种子灭菌后进行播种的方法不可取。因为播种操作麻烦，建议初学者采用未成熟种子进行播种。在成熟期间植株放置的环境对种子成熟的影响很大。在多数情况下，种子成熟期间植株要经过炎热的夏天。若夏天环境不适，种子未十分成熟，蒴果提早开裂。若夏天凉爽子房要经过1年时间子房才变褐色。在这种情况下多数种子已成熟。

三、无菌播种

1、准备

(1)培养基配制：三角烧瓶(300ml～500ml)、橡皮塞(中央开1个直经3mm～5mm的小孔，塞上脱脂棉)；

(2)培养基：如表一所示；

(3)接种；锡铂纸、滤纸、刀片、镊子、金属匙、接种针、蒸馏水、吸管(1ml～5ml)、吸管胶球；

(4)灭菌：烧杯(100ml～250ml)、氯溶液(次氯酸钠溶液，有效氯5％以上；漂白粉也可用)、75％酒精、高压灭菌器、压力锅、超净工作台(无菌箱)。

注意：锡铂纸、滤纸、刀片、镊子、金属匙、接种针等用锡铂纸包好在高压灭菌器内灭菌，无菌水是三角烧瓶装蒸馏水后用橡皮塞塞好再灭菌(但橡皮塞不能完全塞紧，灭菌时若橡皮塞塞紧，由于蒸气压力橡皮塞可能会冲出，使三角烧瓶破裂)。

2、无菌播种

无菌操作原则上在超净工作台或在无菌箱内进行。使用自制的无菌箱时，在使用前用药剂充分消毒，再利用煤气灯或酒精灯。操作时，手经过橡胶手套伸进无菌箱内，使用完全密封的箱子时，不需要煤气灯；将必要的材料(包括种子、苗)放入箱内后，用氯仿、次氯酸钠溶液等进行喷雾，再将药剂放入箱内静置，密闭10～30分钟。由于该无菌箱使用固定的橡胶手套，操作虽自由，但材料、器具搬进搬出受到限制。本文详细介绍最一般使用的超净工作台或利用煤气灯的操作方法。在使用煤气灯时，操作尽量在煤气灯的附近，靠近火焰一侧或稍稍下方处。

四、未成熟种子(未开裂种子)的无菌播种

1、种子的灭菌

(1)剥去子房外的苞片；

(2)切取适当长度(3cm)的花梗；

(3)子房放在煤气灯的火焰上烧掉于房上的细毛。去掉覆盖在子房上的细毛，有利于后面的无菌操作。

(4)在75％酒精中浸1分钟；

在酒精中浸一下目的不是进行灭菌，而是有利于后面的消毒剂的灭菌；酒精灭菌虽可杀死许多细菌，但对真菌和一部分细菌无效。

(5)次氯酸钠等溶液灭菌5分钟。

灭菌液的浓度和灭菌时间有关系。初学者以使用高浓度较为安全，使用原液也无妨。灭菌操作后，后面的操作都必须无菌操作，应十分小心。

(6)打开用锡铂纸包好的灭菌滤纸。

锡铂纸的外面可用干净的手接触，但纸的内部不可接触。用干净的手或镊子拿住花茎的先端，将子房放到滤纸中间，用手在锡铂纸外侧轻轻挤压子房，以吸去灭菌液。

2、切开子房

张开滤纸，用灭菌过的镊子夹住子房的基部，用灭菌过的刀片将子房横向切断，这时注意不要将滤纸切破。

3、播种

三角烧瓶口在火焰上轻轻烧一烧，连盖子一起灭菌，然后打开盖子(橡皮塞)。这时，橡皮塞的安全位置，以比操作的手的位置稍高为好，然后将橡皮塞向上放置。熟练的操作者可用右手的小指夹住橡皮塞进行无菌操作。若橡皮塞上方包有锡铂纸，这样夹住锡铂纸的地方操作最好。

(8)左手用灭菌过的镊子挟住子房基部，将切口放到三角烧瓶口的上方，右手用灭菌过的金属匙伸进子房切口内，将种子挖入三角瓶内。播种后三角瓶口用橡皮塞塞好。其余的种子用同样的方法播种在三角瓶中。

(9)所有三角烧瓶播种后，用灭菌过的吸管向三角烧瓶内加入O．5ml～1ml的无菌水。

(10)三角烧瓶口和橡皮塞在煤气灯的火焰上烧一烧灭菌后，将橡皮塞塞紧，包好锡铂纸。然后将三角烧瓶轻轻左右摇动几下，使种子随着水分分散在培养基表面。如果培养基比较软的情况下，不必加入灭菌水，使用接种针将种子分散在培养基表面。

五、完熟(开裂)种子的播种

(1)将开裂子房的种子取出放在硫酸纸或锡铂纸上；

(2)将种子倒入干净的试管内；

(3)加入消毒用的含氯溶液5ml；

消毒用的含氯溶液有次氯酸钠等(注意使用期限)，原液加蒸馏水稀释后使用，有效氯浓度为0．2％～0．4％。氯溶液中的氯易挥发，用过一次的溶液要丢弃。漂白粉的水溶液的上清液稀释后也可使用，由于有效氯的浓度不清楚， 每次使用都要进行预备试验，初试者最好不用。

(4)加有消毒液的试管用锡铂纸封好，然后用大拇指按住试管口，用力上下摇动3分钟。

(5)之后静置3分钟，具有发芽率的成熟种子沉在试管底下。

(6)用灭菌过的吸管吸去上清液，兜兰的不育种子较多，在消毒液的上部；

(7)用灭菌过的吸管加入5ml～10ml灭菌水；

从加入消毒液到加入灭菌水的时间为7～10分钟，这时间非常重要，消毒时间过短容易引起细菌污染，消毒时间过长，则损伤胚而影响发芽。

为了充分洗净氯离子，用灭菌水冲洗1～2次为好。

(8)洗净后剩下灭菌水0.5ml～ml；

(9)准备好装有培养基a的三角烧瓶，用吸管将种子吸入管内；

(10)播种到装有琼脂的培养基上；

(11)也可洗净后去掉无菌水，用接种针取出种子播种到装有琼脂的培养基上；

不管用什么方法，种子均匀播在培养基表面上为好。

六、三角烧瓶中培养

理想的培养温度应保持在25℃，无特殊装备的研究室比较困难。一般家庭保持室温在20℃～30℃。利用太阳光的情况下，采用帘子或遮光材料遮住阳光的直接照射，以调节温度。利用人工光照(1000lx～5000lx)的情况下，温度容易调节。有利用黑暗条件下进行发芽的方法，一般光照时间14～16小时比较适宜。

种子发芽随杂交种子不同而有差异，发芽早的2周左右就肉眼可见白色的原球茎，但是，发芽迟的要半年至1年陆续出现原球茎，需要耐心等待。如果有真菌或细菌污染的话，早的话数日，迟的话2周内就可以肉眼可见。在这种情况下，收集尚未污染的部分种子，按照开裂种子的灭菌要领，再次灭菌一次，以挽救部分种子。发芽率好的种子可诱导出一层原球茎。在原球茎生长出现绿叶时，分散转接到相同的培养基上为好。方法参照下节的营养培养基的转接方法。苗的叶片长到1cm左右时，转接到营养培养基中。从发芽到苗的根在营养培养基中开始伸长。并长到5mm～10mm长时需要3～6个月。

七、转接到营养培养基

1、准备：

准备营养培养基、接种针、无菌培养皿。

2、转接的方法：

(1)有苗的三角烧瓶口和装有营养培养基的三角烧瓶口在火焰上烧一烧，冷却后打开橡皮塞。

(2)先端弯曲的接种针，特别是伸进三角烧瓶内的部分，在火焰上充分烧一下以灭菌。待接种针冷却(或将接种针插入培养基中使之冷却也可)后，将母苗三角烧瓶中的苗转接到营养培养基中。将母苗三角烧瓶中的苗全部移到无菌培养皿中然后转接到营养培养基也可以。由于多数情况下，不必再转接，这是最后一次的转接，每瓶的转接株数不能太多，一般300ml的三角烧瓶移植10～15株，500ml的三角烧瓶移植20～30株，转接时以苗均匀分布为好。

3、培养条件

培养温度维持在20℃～25℃，基本上以同播种三角烧瓶培养相同环境为好。苗的生长，除培养基成分外，苗的环境条件也是重要的。若生长不良，要检查日照、温度等环境条件。夜间三角烧瓶中有水滴或有水雾这样的环境不好。苗高达4cm～5cm时可出苗。从发芽到出苗一般需1年至1年半。