时间：2022-07-05 02:42:19
摘要：目的优化利福霉素发酵摇瓶中巴比妥钠的添加量及添加策略，以提高发酵产量。方法采用摇瓶发酵，优化巴比妥钠初始含量及中间补加策略，通过测定发酵液中利福霉素B的效价及菌体浓度来确定合适的发酵工艺。结果巴比妥钠添加的优化策略为：初始浓度0.05％，72 h补加至0.1％，120 h补加至0.15％。结论优化工艺使发酵单位显著提高，比不加巴比妥钠提高17%，比目前生产水平提高10％以上。
关键词：利福霉素；地中海拟无枝酸菌；巴比妥；发酵优化
中图分类号：R978.1+5文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)02-0011-03
Optimization of Barbital Sodium Content during Fermentation of Rifamycin B
WANG Jun-feng1, DU Ji-quan2
(1.Shenyang Tonglian Pharmacy Group, Institute of Biological Technology of Shanghai, Shanghai 200237, China; 2. Management Committee of Jinan High & New Technology Developing Zone, Jinan 250002, China)
Abstract：Objective To optimize the content and feeding strategy of barbital sodium during the fermentation of rifamycin B in order to improve the yield. Methods In shaken flask culture, the content and feeding strategy of barbital sodium during the fermentation of rifamycin B was optimized and the suitable fermentation technology was also defined by determining the potency of rifamycin B and PMV of mycelia in fermentation broth. ResultsThe optimal feeding strategy of barbital sodium was obtained, which was that the incipient concentration of barbital sodium was 0.05% in base medium and was added to 0.1% at 72 h, 0.15% at 120 h. Conclusion The yield of rifamycin B is raised significantly with the technology optimized. The productivity of rifamycin B is increased by 17% than that without barbital sodium and 10% more than that produced at the present level.
Key words：rifamycin B; Amycolatopsis mediterranei; barbital; fermentation optimization
利福霉素（rifamycin）是地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）产生的一类安莎（ansamycin）大环内酯抗生素，广泛用于治疗革兰阳性菌（G+）、结核病、麻风病以及与艾滋病有关的分枝杆菌感染[1]。近年分枝杆菌引起的肺结核患者数量呈上升趋势，因此研究利福霉素及其产生菌有重要意义。
从地中海拟无枝酸菌培养液中得到的利福霉素有A，B，C，D，E5种组分，其中主要为B。后来在不同菌种的发酵液中又发现了O，S，SV组分[2, 3]。
利福霉素B只有微弱的抑菌活性，但是，它可以通过化学修饰、酶催化或生物转化成为抑菌活性较高的SV。SV是首个临床应用的利福霉素类抗生素。SV是B生物合成的前体，阻断B合成的菌株可导致SV积累，此方案已经成功地实施[4]，但是经过处理的菌株产量较低。目前商业应用大多先生产B，然后将其转化为O，S及SV，转化关系如图1所示[5]。
图1 利福霉素B转化为利福霉素SV和其他临床应用的类似物
巴比妥（barbital）能够刺激A. mediterranei合成利福霉素，一般认为，它对B的生物合成有诱导作用，在发酵前期增加巴比妥将促进生物代谢定向合成B。最近Mejia 等[6]报告，低通气量时，巴比妥对 A. mediterranei的作用更为明显。在此条件下，含有巴比妥的培养物和对照（不含巴比妥）在CO2生成量上相似，但是，前者O2摄取高于后者，多出的O2被用于增加利福霉素的合成。实验证明，巴比妥是通过激活细胞色素P450型的单加氧酶起作用的。此外，巴比妥有一定的毒性，这与B的生物合成有关[7]。文献报道的巴比妥添加浓度很不一致，因此有必要对此进行考察。
1材料
1.1出发菌株
地中海拟无枝酸菌X-1# （同联制药集团上海生物技术有限公司）。
1.2培养基
一级种子培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉4，蛋白胨4，水解酪素4，氯化钠1.5；
二级种子培养基[8]（g/L）：葡萄糖40，黄豆饼粉25，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 1，Mg SO4 1，CaCO3 12， CuSO4 0.0033， FeSO4 0.01， MnSO4 0.004， ZnSO4 0.05， CoCl2 0.002，钼酸铵 0.001；
摇瓶发酵培养基（g/L）：葡萄糖90，黄豆饼粉25，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 1，Mg SO4 1，CaCO3 12，CuSO4 0.0033， FeSO4 0.01， MnSO4 0.004， ZnSO4 0.05， CoCl2 0.002， 钼酸铵 0.001，巴比妥钠 1.5；
发酵罐培养基（g/L）：葡萄糖90，黄豆饼粉55，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 1，Mg SO4 1，CaCO3 12，CuSO4 0.0033， FeSO4 0.01， MnSO4 0.004， ZnSO4 0.05， CoCl2 0.002， 钼酸铵 0.001， 巴比妥钠 1.5，消沫剂0.02%。
2方法
2.1菌浓和化学效价测定
菌浓（PMV）用离心体积法测定，化学效价用分光光度法测定[9]。
2.2 基础培养基中巴比妥钠含量的优化
将基础培养基中巴比妥钠的含量设定为0.00%，0.15%，0.30%，0.50%及0.70% 5 个水平，培养8 d后测量发酵单位。根据实验结果，在巴比妥钠浓度较低时，进行第2次单因素考察实验。
2.3巴比妥钠补加策略优化
在巴比妥钠不同初始含量的基础上，于发酵后72 h和120 h分别增加巴比妥钠的量，使其浓度分别达到0.1%，0.15%，测定巴比妥钠不同浓度对发酵的影响。
3结果与讨论
3.1基础培养基中巴比妥钠含量优化的结果
巴比妥钠浓度增加到一定水平后，对菌体生长和利福霉素B的合成都产生了明显的抑制作用，并且产率（产量/菌浓）在巴比妥钠浓度为0.15%时最高，此后随着巴比妥钠浓度增高而下降。见表1。
表1不同巴比妥钠加量摇瓶实验结果
*相对值
根据这一结果，降低巴比妥钠浓度，分别为0.00%，0.05%，0.10%，0.15%及0.20%（用水平1，2，3，4，5表示），进行第2次单因素考查实验，结果见图2。
P（1～5）效价；PMV（1～5）菌浓
图2巴比妥钠初始浓度对利福霉素B发酵的影响
当巴比妥钠浓度低于0.2%时，对菌体生长的影响较小，此实验结果与表1一致。此时巴比妥钠的主要作用是刺激菌体合成B，而且巴比妥钠在基础培养基中的初始浓度不同，对B生产能力的影响程度也不同。起始浓度为0.1%时，最终发酵单位最高；浓度为0.05%时，120 h B的发酵单位最高；浓度为0.15% 时，120 h之后效价增长最快。由此推测，逐次提高发酵培养基中的巴比妥钠浓度可能有利于利福霉素B的产生。
3.2发酵过程中巴比妥钠补加策略优化
结果见表2。与对照组相比，增加巴比妥钠的1~9组发酵单位提高，进一步说明巴比妥钠对生产利福霉素B有促进作用。其中第8组效果最好，即巴比妥钠起始浓度为0.05%，72 h补加至0.1%，120 h再补加至0.15，发酵单位比不加巴比妥钠提高17%，比目前生产配方提高10%以上。比较1，4和9还可知，起始浓度为0.1%较合适，这与图2所示的一致。由表2还可见，72 h巴比妥钠的浓度不宜太高，否则会影响产量，可能是因此时菌株还不能够适应这一浓度，而到后期适应性会越来越强。
实验中向利福霉素SV的培养基中添加巴比妥钠没有起到促进作用（结果未给出，Murali[10]也曾在利福霉素添加了巴比妥，发酵单位只比不加巴比妥的提高1.2%），说明巴比妥钠的作用可能发生在利福霉素SV合成之后，这一结果支持巴比妥促进定向合成B的观点。
表2不同时间补加巴比妥钠的实验结果
4结论
巴比妥钠具有刺激菌株产利福霉素B的作用，但是发酵培养基中巴比妥钠的浓度不应高于0.2%，浓度较高对菌体生长和利福霉素B合成都有明显的抑制作用。通过实验筛选出了补加巴比妥钠的优化策略，即初始浓度0.05％，72 h补加至0.1％，120 h补加至0.15％。使用该策略可使发酵单位比不加巴比妥钠提高17%，同时比目前生产水平提高10％以上。
参考文献
[1]Griffith D E, Wallace R J. New developments in the treatment of nontuberculous mycobacterial (NTM) disease [J]. Semin Respir Infect, 1996, 11 (4): 301-310.
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[3]Sensi P, Margalith P. Rifamycin, a new antibiotic [J]. Farmaco Ed Sci, 1959, 14 (2): 146-147.
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[5]Floss H G, Yu T W. Rifamycins mode of action, resistance, and biosynthesis [J]. Chem Rev, 2005, 105: 621-632.
[6]Virgii A, Marcelli I E, Agrimino A. Aeration-agitation studies on the rifamycin fermentation [J]. Biotechnol Bioeng, 1964, (6): 271-283.
[7]Mejia A, Barrios J, Viniegra G. Overproduction of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei and its relationship with the toxic effect of barbital on growth[J]. J Antibiot, 1998, 51 (1): 58-63.
[8]赵成建, 张定丰，金志华. 利福霉素B发酵放大Ⅰ从摇瓶到15L发酵罐的发酵放大 [J]. 中国抗生素杂志，2002，27（7）：398-402.
[9]孟根水. 利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺的优化 [D]. 杭州：浙江工业大学，2002-04-01.
[10] Murali P S, Venkateswarlu G, Venkateswar L. Effect of uracil on rifamycin SV production by Amycolatopsis mediterranei MV35R[J]. Lett Appl Microbiol, 2000, 31 (1): 73-76.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”