候选易感基因NEDD4与瘢痕疙瘩发病关系的研究进展

病理性修复是以胶原为主的细胞外基质成分的大量沉积，可导致真皮组织过度增生而出现病理性瘢痕，包括局限性生长的增生性瘢痕和生长超过创缘的瘢痕疙瘩。目前的治疗方法主要为手术切除，但临床易复发，无特效处理办法，是整形外科、皮肤科、烧伤科领域的常见病、难治病，严重影响患者的正常生活及心理健康。目前，学术界普遍认为瘢痕疙瘩有一定的遗传倾向，属于多基因、多因子共同作用所致，近年来对瘢痕疙瘩基因水平的研究越来越多，2010年，日本学者Mitsuko[1]首次对日本人瘢痕疙瘩的全基因组关联研究（GWAS），最先发现了NEDD4基因上与瘢痕疙瘩发病相关的位点。随后，不断有学者进行NEDD4基因与瘢痕疙瘩的探讨。本文就NEDD4基因与瘢痕疙瘩发病关系作如下综述。

1 瘢痕疙瘩的遗传易感性

近年来，学者们通过遗传学研究越来越倾向于瘢痕疙瘩属于“复杂性疾病”，所谓复杂性疾病，又称为多基因病，是由两个或两个以上基因与环境因素共同作用所导致的疾病，其遗传方式不遵循简单的孟德尔遗传模式，遗传因素对疾病的影响只起部分作用，具有明显的遗传异质性、表型复杂性及种族差异性等特征[2-3]。瘢痕疙瘩为人类所特有的，可发生于所有人群，不同种族中患病率也不相同，非裔和亚裔等有色人种中有较高的患病率，尤其是黑人[4]。瘢痕疙瘩的发生具有明显的家族倾向，而且同卵双胞胎中发病率很高，瘢痕体质者也具有一定的家族遗传倾向[5]。到目前为止，瘢痕疙瘩的遗传方式尚无定论。国外学者通过对不同的瘢痕疙瘩家系调查分别得出该病为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传等不同的遗传模式，大部分学者趋向于认为瘢痕疙瘩为常染色体显性遗传，但并非简单的孟德尔式单基因遗传，还有学者认为该病基本符合常染色体显性遗传伴临床不完全外显及可变的表现度[6-7]。

随着人类基因组计划和国际单体型图计划（Hap-Map）的完成，以及高通量基因分型技术的出现，进一步推动了复杂疾病易感基因的研究，使得复杂疾病易感基因的全基因组关联分析（GWAS）研究成为现实。日本学者Mitsuko首次对日本人瘢痕疙瘩的GWAS发现与瘢痕疙瘩发生有关的4个SNP位点，其中rs8032158位于NEDD4基因上。NNEDD4基因位于15q21.3，其表达产物E3泛素连接酶，在骨骼肌、膀胱、肝脏和皮肤中高度表达。NEDD4基因保守性较低，其表达产物为NEDD4家族蛋白，是由碳端的HECT结构域，氮端的C2域以及2～4个WW域组成，而其中具有泛素连接酶活性的成分为碳端的HECT域[8]。国内杨洋等[9]认为单核苷酸多态性位点rs8032158位于NEDD4-1基因的内含子区，难以解释对基因表达的影响，因而筛选出位于NEDD4-1基因功能区的3个SNPs位点（rs17819300，rs4774833，rs10518830）进行了与中国汉人瘢痕疙瘩的关联分析，结果显示在rs10518830这一位点上与对照组存在显著差异。推测其可能参与了瘢痕疙瘩的发病过程。Zhu等[10]筛选与瘢痕疙瘩发病相关的12个SNPs位点对中国汉人进行了一项大样本研究（瘢痕疙瘩组714例，对照组2944例），rs2271289、rs873549和rs1442440 3个易感位点在中国汉族人群中被验证出来，另外揭示了中国汉族瘢痕疙瘩患者和日本患者之间不仅存在共同的遗传发病机理，还存在遗传异质性。这些与既往报道提出的瘢痕疙瘩遗传异质性、表型复杂性及种族差异性等特征相吻合，鉴于目前对于NEDD4与瘢痕疙瘩之间的相关研究较少，以上研究结果还需进一步证实。

2 NEDD4与瘢痕疙瘩相关的泛素化过程

泛素化是一种依赖于ATP的蛋白降解过程，包括E1泛素活化酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶、蛋白酶体等多种酶类，参与体内多种蛋白降解，泛素之称来源于此。首先，在ATP参与下，游离的泛素被El激活，然后，活化的泛素被转移到E2的活性半胱氨酸残基上，形成高能硫酯键。接着，E2再将泛素传递给相应的E3。E3可特异性地识别底物，并可直接或间接地促进泛素转移到靶蛋白上，或转移到已与靶蛋白相连的泛素上形成多聚泛素链。以上即泛素化过程。其中E3泛素连接酶在泛素化过程中需要特异性识别降解的底物并将E2泛素结合酶中的泛素标签与底物连接，在泛素化过程中发挥着重要作用。

E3泛素连接酶参与多种肿瘤的形成。E3泛素连接酶相关（CUL4A）基因[11]，在鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌、儿童成神经管细胞瘤、肝细胞癌、肺癌和原发性恶性胸膜间皮瘤、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在着异常扩增或表达[12-15]。而且，CUL4A基因高表达与总生存率和无病生存率缩短有密切相关性，这表明CUL4A基因的异常调节可能促进肿瘤形成。NEDD4所编码蛋白也属于E3泛素连接酶。目前在人类发现的NEDD4家族蛋白共包括9种：Nedd4-1、Nedd4-2、Smurf1、Smurf2、Itch、WWP1、WWP2、NEDL1、NEDL2。目前对于NEDD4家族蛋白参与的泛素化过程与瘢痕疙瘩之间关系研究极少，参与机制不明确。日本学者Mitsuko[1]对日本人瘢痕GWAS研究所检测出的NEDD4基因为其中的NEDD4-1型。NEDD4-1通过对PTEN的泛素化降解过程来调节细胞的增殖和凋亡。

E3泛素连接酶之一的Smurf2可通过泛素化过程对TGF-β受体进行降解[16]，TGF-β在瘢痕疙瘩形成中有促进纤维化的作用以及参与成纤维细胞和单核细胞趋化作用。Laine等[17]研究认为，WWP1作为具有HECT结构的泛素酶对p53有明显的调节作用，而p53蛋白在细胞周期的调节、细胞的分化与凋亡过程中具有重要意义。不同于经典的泛素化过程，WWP1对p53的泛素化带来的结果是增加p53蛋白的稳定性以及减少p53的转录。p53作为广谱的抑癌基因参与很多肿瘤的形成，在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中存在异常表达，因此，我们推测瘢痕疙瘩的发生可能也存在着泛素化过程相关的p53异常。

3 NEDD4对成纤维细胞的调控

病理性瘢痕的实质是以成纤维细胞增殖、活性增强，并产生大量以胶质为主的细胞外基质为主要改变的一种疾病。真皮中成纤维细胞（fibroblast）在瘢痕形成中起着重要作用。与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩的成纤维细胞在离体时可继续产生高水平的胶原、纤维黏连蛋白（fibronectin，FN）、弹性蛋白、蛋白多糖等细胞外基质（extracellular matrix），对糖皮质激素、生长因子等代谢调节剂的反应异常[18]。从组织学来看，瘢痕疙瘩成纤维细胞呈扁平长梭形，表皮角质形成细胞明显增生，细胞层次明显增加，中央部及边缘部细胞均排列紊乱，极性消失，普遍存在细胞交错重叠现象。吴莹等[19]对正常细胞和瘢痕疙瘩增殖-凋亡差异性的比较研究得出，与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡明显减弱。

瘢痕疙瘩的形成最终依赖成纤维细胞，这促使学者们也探究成纤维细胞出现异常的机制。2011年，日本学者Chung 等[20]报道了NEDD4-1基因表达水平的变化可影响成纤维细胞的增殖和迁移能力。通过将携带有人NEDD4-1基因的质粒转染到正常人皮肤成纤维细胞，得出过度表达的NEDD4-1促进成纤维细胞的生长。该基因编码的蛋白质为E3泛素连接酶，通过对PTEN蛋白的泛素化对其降解，经PTEN/Akt途径最终磷酸化p27蛋白、β-连环蛋白等。伤口愈合过程中，p27、β-连环蛋白等是细胞间接触抑制的最重要分子[21]，达到一定的细胞浓度或/和细胞间直接接触时能抑制成纤维细胞的活动和迁移。当成纤维细胞NEDD4-1过度表达可出现细胞间接触抑制减弱，造成成纤维细胞的增殖、迁移。

3.1 PTEN

PTEN是1997年li等[22]首次在乳腺癌患者移植瘤体中分离出来的一种抑癌基因，已被证实参与人类多种肿瘤的形成，PTEN因具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性而调节细胞的转移和黏连以及生长和迁移，其脂质磷酸酶活性可以抑制PI3K/Akt信号传导[23]，所以，当PTEN蛋白出现变性失活及功能丧失的改变可使Akt活跃。

3.2 p27

p27是一种激酶抑制因子，当细胞密度变大或细胞直接接触时对细胞的迁移和增殖有抑制作用，可将细胞周期阻滞在不同时相[24]。Chung[20]研究得出其在瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期中扮演重要角色。过度表达的NEDD4-1基因通过泛素化PTEN使PI3K/Akt受到的抑制解除，活跃的Akt磷酸化p27，p27为磷酸化依赖降解途径的蛋白，这一过程造成p27减少，难以完成调节细胞周期的作用，成纤维细胞无法正常凋亡，出现异常增殖及迁移。

3.3 β-连环蛋白

β-连环蛋白为一种多功能蛋白，通过与细胞骨架的相互作用，协助细胞对细胞外信号和影响作出反应。在细胞核内充当转录因子，启动细胞分裂基因。有研究指出β-连环蛋白的沉积不仅可见于增生性瘢痕，还可见于瘢痕疙瘩[25]。过度表达的NEDD4-1基因通过泛素化PTEN使PI3K/Akt受到的抑制解除，活跃的Akt磷酸化β-连环蛋白，促使该蛋白的基因转录沉积于细胞质中，在向细胞核转移过程中与连接TCF/LEF-1启动因子藕连，诱导下游基因cyclin D1和MMP7的表达。而这些基因调控上皮间质转移（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。在EMT过程中β-连环蛋白被上调并沉积于细胞质或细胞核中，位于细胞核内的β-连环蛋白促进TCF/LEF转录因子并激活目标基因。

4 NEDD4对细胞外基质沉积的调控

NEDD4-1调控成纤维细胞细胞外基质（ECM，extracellular matrix）I型胶原和纤连蛋白的沉积。Chavez等[26]认为细胞外胶原过度沉积为瘢痕疙瘩的特征之一，为阐明瘢痕疙瘩胶原及其它机制相关分子的沉积，Chung等[20]将体外培养的成纤维细胞NEDD4-1基因敲除，发现I、III型胶原均下降，而在转染了NEDD4-1基因的成纤维细胞中I型胶原表达上调。蛋白印记分析显示，敲除NEDD4-1基因的成纤维细胞其细胞外纤连蛋白分泌与细胞内该蛋白的分泌减少类似。

5 多基因共同作用

众所周知，瘢痕疙瘩患者多有家族史，有一定的遗传易感性却不是单基因的疾病。目前普遍认为瘢痕疙瘩是在一定遗传基础上，创伤后在炎症、细胞因子、基因等共同作用下出现的。除了NEDD4基因外还有很多基因被证实与之相关。尤其是抑癌基因的异常与瘢痕疙瘩高度相关，包括p53基因，转化生长因子β（TGF-β）基因等，而本文中提到的PTEN基因实际上也是一种抑癌基因，这与瘢痕疙瘩手术切除后易复发均证实了瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长倾向。

p53基因定位于17q13.1，为重要的抑癌基因之一，调控细胞周期，属于调节基因和凋亡基因，多数肿瘤的发生与其突变或缺失有关。p53基因家族成员在瘢痕形成过程中起着重要的调控作用，其基因突变可能是瘢痕疙瘩浸润性生长及治疗后易复发的原因[27]。Saed等[28]对瘢痕疙瘩组织中分离出的成纤维细胞培养，检测到与细胞周期调节有关的p53 基因外显子存在着DNA碱基突变、缺失的改变，推测p53 基因突变可能是导致瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡受抑，增殖失控的原因之一。在瘢痕疙瘩边缘部的增生部位有p53蛋白表达，但p53基因的突变使其失去抑制细胞增生的能力，致使瘢痕疙瘩边缘增生区细胞增生、凋亡减少，成纤维细胞增殖和凋亡失衡。TGF-β基因家族有6种分型，其中TGF-β1在瘢痕疙瘩发病机制中尤为重要，TGF-β是一类具有多生物学功能的蛋白多肽类物质，在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用[29]，能促进胶原和纤连蛋白等细胞外基质的合成与分泌，诱导瘢痕疙瘩形成。Liu等[30]研究发现TGF-β1与TGF-β2可促进成纤维细胞增殖，以及分泌纤维蛋白和胶原，而TGF-β3有拮抗TGF-β1与TGF-β2的作用，抑制瘢痕的形成。

6 展望

瘢痕疙瘩具有难治性、易复发性的特点，其发病机制至今尚未明确，涉及基因、细胞因子、炎症介质、免疫应答、环境因素等多方面因素，且各因素之间并非完全独立。瘢痕疙瘩存在多种易感基因，是一种复杂疾病，而本文就其中的候选易感基因NEDD4与瘢痕疙瘩的关系进行综述，未来的研究还需要多学科、多角度、综合性研究对瘢痕疙瘩发病机制的探讨，相信随着基因工程技术的进展，学术界终能攻破难题，揭示瘢痕疙瘩的发病机制，为探索瘢痕疙瘩治疗新手段提供理论基础。

[参考文献]

[1]Nakashima M，Chung S，Takahashi A，et al.A genome-wide association study identifies four susceptibility loci for keloids in the Japanese population[J].Nat Genet，2010，42（9）：768-771.

[2]Lander E，Kruglyak L.Genetic dissection of complex traits：guidelines for interpreting and reporting linkage results[J].Nat Genet，1995，11（3）：241-247.

[3]Sabatti C，Service S，Freimer N.False discovery rate in linkage and association genome screens for complex disorders[J].Genetics，2003，164（2）：829-833.

[4]Sun LM，Wang KH，Lee YC.keloids incidence in Asian people and its comorbidity with other fibrosis-related diseases：a nationwide population-based study[J].Arch Dermatol Res，2014，306（9）：803-808.

[5]Bayat A，Arscott G，Ollier WE，et al. Keloid disease：clinical relevance of single versus multiple site scars[J]. Br J Plast Surg，2005，58 ：28-37.

[6]Mameros AG，Norris JE，Watanabe S，et al.Genome scans provide evidence for keloids susceptibility loci on chromosomes 2q23 and 7p11[J].J Invest Dermatol，2004，122（5）：1126-1132.

[7]周顺铭，杨森，李伟，等.瘫痕疙瘩的临床和流行病学特征[J].安徽医科大学学报，2006，41 （3）：114-116.

[8]Ingham RJ，Gish G，Pawson T.The NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases：functional diversity within a common modular architecture[J].Oncogene，2004，23（11）：1972-1984.

[9]杨洋，张暖，刁建升，等.NEDD4基因启动子区SNP位点与瘢痕疙瘩遗传倾向性的关联分析[J].中国美容整形外科杂志，2013，24（2）：105-108.

[10]Zhu F，Wu B，Li P，et al.Association study confirmed susceptibility Loci with keloids in the Chinese Han population[J].PLoS One，2013，8（5）：e62377

[11]Lee J，Zhou P.Pathogenic role of the CRL4ubiquitin ligase in human disease[J].Front Oncol，2012，6（2）：21.

[12]Yeung B，Ho KC，Yang X，et al.WWP1 E3ligase targets LATS1 for ubiquitin-mediated degradation in breast cancer cells[J].Plos One，2013，8（4）：e61027.

[13]Wang Z，Wang J，Li X，et al.Bortezomib prevents oncogenesis and bone metastasis of prostate cancer by inhibiting WWP1， Smurf1 and Smurf2[J].Int J Oncol，2014，45（4）：1469-1478.

[14]Zhang L，Wu Z，Ma Z，et al.WWP1 as a potential tumor oncogene regulates PTEN-Akt signaling pathway in human gastric carcinoma[J].Tumor Biol，2015，36（2）：787-798.

[15]汪治宇，刘荣凤，丁 妍，等.泛素连接酶 WWP1和Smurfs 在前列腺癌组织中的表达及其与骨转移的关系[J].中国现代医学杂志，2012，22（20）：66-70.

[16]Ogunjimi AA，Briant DJ，Pece-Barbara N Le，et al.Regulation of Smurf2 ubiquitin ligase activity by anchoring the E2 to the HECT domain[J].Mol Cell，2005，19（3）：297-308.

[17]Laine A，Ronai Z.Regulation of p53 localization and transcription by the HECT domain E3 ligase WWP1[J].Oncogene，2007，26（10）：1477-1483.

[18]Hamburg-Shields E，DiNuoscio GJ，Mullin NK，et al.Sustained β-catenin activity in dermal fibroblasts promotes fibrosis by up-regulating expression of extracellular matrix protein-coding genes[J].J Pathol，2015，235（5）：686-697.

[19]吴莹，尚经轩，白定群，等.正常皮肤与瘢痕疙瘩增殖一凋亡差异性的比较[J].激光杂志，2008，29：89-90.

[20]Chung S，Nakashima M，Zembutsu H，et al.Possible involvement of NEDD4 in keloids formation；its critical role in fibroblastproliferation and collage production[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2011，87（8）：563-573.

[21]Levenberg S，Yarden A，Kam Z，et al.P27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry[J].Oncogene，1999，18：869-876.

[22]Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer[J].Science，1997，275：1943-1947.

[23]Scheid MP，Woodgett JR.PKB/AKT：functional insights from genetic models[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（10）：760-768.

[24]Armenia J，Fabris L，Lovat F，et al.Contact inhibition modulates intracellular levels of miR-223 in a p27kip1-dependent manner[J].Oncotarget，2014，15（5）：1185-1197.

[25]Sato M.Upregulation of the Wnt/betacatenin pathway induced by transforming growth factor-beta in hypertrophic scars and keloids[J].Acta Derm Venereol，2006，86（4）：300-307.

[26]Chavez-Munoz C，Hartwell R，Jalili RB，et al.SPARC/SFN interaction， suppresses type I collagen in dermal fibroblasts[J].J Cell Biochem，2012，113（8）：2622-2632.

[27]Wu Y，Wang B，Li YH，et al.Meta-analysis demonstrates association between Arg72Pro polymorphism in the P53 gene and susceptibility to keloids in the Chinese population[J].Genet Mol Res，2012，11（2）：1701-1711.

[28]Saed GM，Ladin D，Olson J，et al. Analysis of p53 gene mutation in keloids using polymerase chain reaction-based single-strand conformational polymorphism and DNA sequencing[J]. Arch Dermatol，1998，134：963-972.

[29]Rhett JM，Ghatnekar GS，Palatinus JA，et al.Novel therap ies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds[J].Trends Biotechnol，2008，4（26）：173-180.

[30]Liu W，Wang DR，Cao YL.TGF-beta：a fibrotic factor in wound scarring and a potential target for anti-scarring gene therapy[J].Curr Gene Ther，2004，4（1）：123-136.

[收稿日期]2015-04-15 [修回日期]2015-05-28