MicroRNA对干细胞生物学行为的调控

【摘要】 目的：随着人类基因组计划的完成, 对于rna在生物体内功能的研究日益受到重视。自1993年的第一个microrna（mirna)，lin?4，发现以来，人们逐渐意识到生物体内有这样一些非编码的rna，它们对基因的表达调控起着非常重要的作用。研究表明, 在生物界存在着一个庞大的mirna家族, 参与调控生物体生长发育等许多复杂的生命过程, 并且与干细胞的自我更新和多向分化存在着紧密关联。mirna通过与靶位点结合快速有效地降解靶基因mirna或抑制蛋白质的翻译，下调cdk,cyclin,p21,p27等关键的细胞周期调控因子的表达，调控各种类型干细胞的更新与分化；mirna还可以决定干细胞的命运，促进ips。本文主要论述了干细胞中mirna作用通路及其对干细胞生物学行为的调控。

【关键词】 microrna；干细胞；自我更新；分化；诱导多能干细胞

micrornas(mirnas)是一些长度为21-25个核苷酸，在转录后水平调控基因表达的非编码的小rnas。mirnas最早的两个成员是在研究c.elegans的发育调控时发现的。自此，在几乎所有的后生动物如涡虫，果蝇，植物，哺乳动物的基因组中都发现了mirnas[1]。它们主要作用于mirna，使其发发生特异性地降解或者阻止其翻译，从而调控动植物的发育和生理过程。

干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的早期未分化细胞, 不仅是器官发生过程中早期分子活动的研究工具, 且已成为多种退行性疾病组织修复和再生的种子细胞。由于干细胞具有广泛的应用前景, 相关的发育分化模型的建立、干细胞发育分化的基因调控及微环境的影响, 已成为近年来医学和生物学领域研究的热点。mirnas作为一个广泛存在的可对基因表达进行调控的分子, 在动植物的发育和生理活动中起着非常重要的作用，包括抵御病毒，在发育中调控基因的表达，控制发育的阶段，维持干细胞的稳定等等。mirnas在干细胞中的特异性地表达，尤其在胚胎干细胞和造血干细胞中相关mirnas的发现、功能的研究, 揭示了mirnas 可能在干细胞的自我更新和多项分化中发挥重要作用。

1mirna和干细胞的研究

mirna是一类～22 nt具有调控功能的非编码rna ，它们主要参与基因转录后水平的调控。这些mirna 基因首先在细胞核内转录成前体转录本(primary transcripts mirna, pri?mirna) ，在drosha酶的作用下剪切形成～60-70nt的mirna前体（或者称为pre?mirna），然后ran?gtp和exportin 5将pre?mirna转运到细胞质，随后，另一个核酸酶dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的mirna:mirna*双链。这种双链很快被引导进入rna诱导沉默复合体(risc)中，其中一条单链mirna被降解，另一条成熟的单链mirna分子，通过与靶基因的3′ utr区互补配对，对靶基因mirna进行切割或者翻译抑制[2]。mirna具有如下特点[3-5]：①细胞特异性：不同组织不同细胞，mirna的表达谱及序列特征不同，这可以作为某些组织或细胞的特异性分子标志； ②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，mirna 组成不同，在特定细胞的特定阶段“出现”特定的mirna ，决定细胞的分化方向和分化时相，是细胞定时、定向分化的开关； ③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同或相似的mirna分子具有相似的调控功能；④mirna作用靶点：多为呈“时空”特异性表达的转录调控基因以及凋亡调控基因，通过调控细胞增殖和细胞凋亡，从而调控细胞功能和结构的特化。

干细胞具有多向分化潜能，它如何从一个充满各种可能性的通用细胞类型演变成从事特定工作的“专业”细胞，是干细胞研究的谜题。 近年来，mirna 在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现，目前已经掀起mirna在干细胞研究中的热潮。

目前发现胚胎干细胞和多种成体干细胞中均存在各自特异的mirna。houbavity等[6]在小鼠胚胎干细胞中克隆了15个mirna ,suh等[7]则在人胚胎干细胞中找到了36个mirna基因，这些mirnas多数在胚胎发育过程中逐渐减少，少数持续表达甚或表达升高。随着细胞的分化，mirnas的表达也发生了明显的改变。mirnas和mirnas的相互作用对于维持干细胞的多能性及其分化非常重要。因此许多试验希望可以通过分析人胚胎干细胞中的mirnas的表达来描述人的胚胎干细胞。

2 mirna对干细胞生物学行为的调控

2.1 mirna调控了干细胞的自我更新

自我更新是干细胞的一个重要特征，从这个层面来说，干细胞与肿瘤细胞一样都可以持续分裂。 因此，如何调节恰当的细胞分裂，使其不会因为太少导致组织发生缺陷，又不至于过分增殖恶化为肿瘤，是干细胞生物学研究的一个攸关问题。

在多能胚胎干细胞中，有特殊mirna的簇集表达，这些mirna明显区别于分化之后的胚胎和成体[7]，暗示这些mirna对于干细胞的自我更新具有一定作用。决定细胞继续增殖还是停止分裂或分化，在g1期由周期依赖性蛋白激酶抑制子p21所调控[8] 。

有研究者通过使用果蝇胚胎作为模型系统，证明了mirna?1有助于早期胚胎阶段的心脏祖细胞（即干细胞）的决定。mirna?1有助于维护末期胚胎阶段中的心脏前体，可以调节心脏细胞的分化机制。这都说明mirnas调控了干细胞的自我更新。

另外，dicer酶对于胚胎的发育和干细胞的维持是必不可少的。dicer敲除的突变体在发育早期胚胎是致死的，在dicer?null的胚胎中，根本检测不到es细胞系[9]；dicer缺陷的“escaper”和dicerflox/null 细胞相比，细胞周期发生了改变，g1期和g0期的细胞有了轻微的增加，相应地，g2期和m期的细胞减少。这种现象可能是由于本应该在es细胞中表达的抑制细胞周期抑制子的mirnas的缺失导致的。基因组的组成和结构也受到了影响从而激发了细胞周期检验点的反应，阻止了细胞的进一步增值[10]。

mirnas对于果蝇的gscs的分化的控制是必不可少的。果蝇基因组中有两种dicer异构酶：dicer?1和dicer?2[9]。dicer?1对于干细胞的加工是必需的，而dicer?2是形成sirna所必需的。dicer?1(dcr?1)的缺失完全破坏了mirna途径，但对sirna途径的影响是非常微弱的。分析gscs的dcr?1突变体发现，生殖细胞孢囊的产量明显下降。gscs的dcr?1的突变体看起来是正常的，但是在细胞周期控制方面存在明显的缺陷。根据细胞周期标记物和一些遗传的相互作用的研究发现，gscs的dcr突变体推迟了g1到s期的转换。干细胞对外界的信号非常敏感，比如营养依赖的胰岛素受体活化可以使干细胞停滞在g1/s 期。胚胎干细胞是通过mirna通路来调节p21/p27/dacapo 对cdk的抑制作用从而使自身停滞在g1/s期。当外界环境不利于干细胞分裂时，关键的mirna被下调，p21/p27/dacapo的水平上升，从而导致干细胞停滞在g1/s 期[11]。但是，参与此过程的具体mirna是哪些，至今仍未有报道，更深入的机制仍需研究。对于成体哺乳动物干细胞是否有类似的mirna?p21调节机制以及是否依赖于环境因素，也还需要更多的实验证实。

2.2 mirna参与神经干细胞的分化调控过程

神经系统是一个高度分化的器官，在已经鉴定的mirnas中，约有70％可以在哺乳动物的脑中检测到，说明了这些mirnas在神经发生中可能的作用[12]。对哺乳动物脑发育过程中高度表达的mirnas的研究表明，在发育起始的mirnas和特异性分化后表达的mirnas有显著的不同[13]。前体细胞顺序表达一系列mirnas，在分化过程中发生了特异性的表达。例如小鼠胚胎干细胞中的mirna?124a 和mirna?9特异性地决定神经干细胞的发育形成, 并且初步推测可能是通过作用于stat信号转导通路发挥作用[14]，mirna?23，mirna?26和mirna?29的上调表达导致分化形成神经胶质，而mirna?9和mirna?125在神经元和神经胶质细胞中均有表达。let?7家族成员也高度存在于神经系统中。在斑马鱼的神经组织和老鼠的发育过程中[41]，let?7家族成员都是高度表达的。在神经分化过程中，通过转录激活和增强前体物的加工活性可以显著诱导let?7家族成员的成熟，这表明了let?7在神经特异分化中的作用[15]。

预测还发现，在成年的哺乳动物中，含量最为丰富的是mirna?124，有1100多个基因的结合位点。将mirna?124导入hela细胞中，可以下调100多种基因的表达[16]，并且促进了神经样mirna的表达。最近，在鸡的神经管中发现层粘连蛋白gammal和整合素betal1也是mirna?124的作用位点。而且，mirna?124可以和小的c端结构域磷酸酶1（scp1）的3’utr结合，这种磷酸酶在神经发育过程中起着重要作用。识别神经系统中mirna的靶序列对于我们更好地了解神经干细胞的自我更新和分化是非常重要的。

2.3 mirna调控造血干细胞的发育

造血干细胞定向分化潜能受mirna调控，在各系祖细胞中高表达mirna可能起着定向分化调控作用。chen等[17]在小鼠的骨髓造血细胞中克隆了100个特异的mirna ,并已确定一些mirna在造血组织中优先表达, 如mirna?142在b淋巴细胞和髓系粒细胞中表达增高，mirna?181在b淋巴细胞中选择性表达上调，其中，mirna?181在骨髓祖细胞阴性谱系中高水平表达并只在b淋巴细胞中上调，在体内和体外mirna?181的过表达可提高b细胞的数量，表明mirna?181可能是b细胞分化中的一个正调节因子，参与造血干细胞向b细胞谱系的分化。

felli 等[18]发现，在脐血cd34 +造血祖细胞向红系发育过程中，mirna?221和222表达逐渐下降。这2个mirna作用于kit基因的3′utr，在cd34 +细胞中转染mirna?221和222的寡核苷酸或者慢病毒表达载体，可导致红系增殖和分化障碍，伴随kit蛋白水平下降。nod?scid小鼠体内实验表明，转染后cd34+细胞的增殖能力和干细胞功能受损；反之，阻断mirna?221和222表达，则促进早期红系增殖。实验表明，mirna?221和222的表达下降可促进红系发育。

最近发现，mirna还调控了造血干细胞自我更新[19] 。造血干细胞能够制造对分化成血细胞至关重要的蛋白质，但是这些蛋白被1套mirna阻断，将造血干细胞维持在原始状态。利用非增殖病毒载体将mirna转染入造血干细胞，检测造血干细胞的自我更新能力。第1个进行检测的是mirna?155，已经被证实能够终止干细胞发育成红血球和白血球，没有转染的干细胞可以发育成熟，而转染了mirna?155的干细胞则很少能发育成熟为红血球和白细胞。

3 mirna决定了干细胞的命运

3.1 mirna操纵胚胎干细胞的命运

研究表明两种依赖于血清应答因子（serum response factor,srf）的肌特异mirna?1和mirna?133，能促进胚胎干细胞的中胚层形成，同时在心肌祖细胞的进一步分化过程中有着不同的作用：mirna?1能促进小鼠和人类胚胎干细胞向心脏细胞的分化过程，而mirna?133则阻止肌浆蛋白祖细胞的分化，mirna?1和mirna?133在发育的肌细胞中是同时表达的。mirna?1和mirna?133是一种强有力的非肌性基因表达的抑制因子，并且能抑制小鼠以及人类胚胎干细胞分化过程中的细胞命运。两种mirna都增加了胚胎干细胞的中胚层特异性，并且抑制它们向内胚层及神经外胚层的分化。

其中，mirna?1的作用部分通过notch ligand delta?like 1（dll?1）的翻译阻遏实现，mirna?1的表达导致dll?1的翻译阻遏，并利用shrna降低干细胞中dll?1的表达。此外，mirna?1和mirna?133能强有力的抑制内胚层以及神经外胚层的基因表达，这表明两者之间或许有着很多共同作用目标。对于胚胎干细胞的基因表达分析表明，mirna?1和mirna?133调节多个相同通路。可见肌特异性mirna能增强非肌性基因的抑制，并且mirna能用于多能胚胎干细胞的细胞命运调节[21]。

3.2 mirna提高了ips的转化效率

自ips出现以来，转化效率一直是横跨在ips技术面前的障碍。有研究表明，将头发里的角质细胞进行重组诱导ips细胞，发现转化效率可提高100倍。最近发现将两种因子p53 sirna和utf1和四个诱导基因（oct4,sox2,klf4和c?myc)一起转染到人成纤维细胞中，ips的诱导效率也可提高100倍，而且，剔除c?myc（具有致癌性基因）同样可以成功诱导ips[22]。

4 展望

不同的干细胞类型表达的mirnas不同，在干细胞的不同发育阶段也存在着特异性的mirnas的表达，我们有理由相信，mirnas在调控干细胞的分化和自我更新方面具有非常重要的作用。mirna作为一种新的调控基因表达的小分子rna，对干细胞的研究提供了一种新的途径。

随着干细胞复杂的分化调控的研究，我们将更好地了解mirnas和一些转录因子的相互作用，从而弄清整个细胞内的调控网络。目前关于mirnas对于干细胞生物学行为调控的研究还很少，mirnas在干细胞中究竟是如何起作用的？它的作用靶位有哪些？关于其调控分化的模型在哺乳动物也成立么？这些问题都有待进一步地探讨。基于多分化潜能和功能谱系不同的干细胞是由遗传和表观遗传共同决定的，作为组织工程的“种子细胞”，弄清它内部的mirnas的作用通路，有助于揭示干细胞发育过程的基因调控。我们的终极目标是希望将mirnas调控干细胞的分化作为一种潜在的治疗手段，以便更好地了解一些特异性的细胞通路中的mirnas，治疗癌症等疾病。

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