银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸的LC―MS/MS含量测定研究

[摘要]该实验建立了同时测定银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸含量的LC-MS/MS方法。采用Agilent Zorbax Eclipse plus C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）;流动相甲醇-0.2%甲酸水（95∶5），等度洗脱;流速0.5 mL・min-1;质谱条件：采用ESI-多反应监测（MRM）模式扫描。结果显示，5种银杏酸在0.2～36.0 μg・L-1线性关系均良好（r≥0.999 5）;银杏酸C13∶0（白果新酸），C15∶1，C17∶2，C15∶0，C17∶1的最低定量限（LOQ）分别为0.18，0.18，0.21，0.10，0.20 μg・L-1;平均回收率在73.28%～87.56%;3批样品中所含总银杏酸的质量分数为0.023～0.028 μg・g-1，均远低于药品注册标准规定的限度（含总银杏酸以白果新酸计，不得过百万分之二）。该方法简便、快捷，灵敏度高，可用于银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸的快速测定。

[关键词]银杏二萜内酯葡胺注射液原料;银杏酸;LC-MS/MS;含量测定

Determination of five kinds of trace ginkgolic acids in diterpene ginkgolides

meglumine injection materials by LC-MS/MS

SI Hai-hong1，2， LI Yan-jing1，2， XUE Jia1，2， HUANG Wen-zhe1，2， WANG Zhen-zhong1，2， XIAO Wei1，2*

（1.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China;

2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]To develop a LC-MS/MS method for the determination of five kinds of trace ginkgolic acids in diterpene ginkgolides meglumine injection materials， the column was Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 （3.0 mm×50 mm， 1.8 μm）， and the mobile phase consisted of methanol-water （containing 0.2% formic acid） （95∶5） at a flow rate of 0.5 mL・min-1. The multiple reaction ion monitoring （MRM） with an ESI interface in the negative ion mode was selected. The results showed that the linear ranges of five kinds of ginkgolic acids were in the range of 0.2-36.0 μg・L-1 （r≥0.999 5）. The lowest limit of quantification （LOQ） of ginkgo acid C13∶0， C15∶1， C17∶2， C15∶0 and C17∶1 were 0.18， 0.18， 0.21， 0.10 and 0.20 μg・L-1， respectively. The average recovery was between 73.28% and 87.56%， and the average content of total ginkgolic acids in three batches of samples was in the range of 0.023-0.028 μg・g-1， which was much lower than 2 μg・g-1 prescribed in drug registration standards. This method is simple and rapid with high sensitivity， which can be used for the determination of five kinds of trace ginkgolic acids in diterpene ginkgolides meglumine injection materials.

[Key words]diterpene ginkgolides meglumine injection materials; ginkgolic acids， LC-MS/MS; quanlitative analysis

doi：10.4268/cjcmm20151427

银杏酸（ginkgolic acids， GA）是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物，6位上的侧链碳原子数在13～19，侧链双键数在0～3^[1]。其中，银杏叶中常见银杏酸有5种，分别为银杏酸C13∶0（白果新酸），C15∶1，C17∶2，C15∶0和C17∶1，结构见图1。研究表明，银杏酸具有致敏性、细胞毒性和免疫毒性等作用^[2-3]，是银杏叶中的主要有毒成分，已被2010年版《中国药典》作为银杏叶提取物的限量检测指标^[4]，以白果新酸计，不得过百万分之十。

银杏二萜内酯葡胺注射液原料为江苏康缘药业股份有限公司已上市品种银杏二萜内酯葡胺注射液的原料药，银杏二萜内酯葡胺注射液主要成分为银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K等，具有活血通络之功效。临床及药理研究表明，该注射液对动脉粥样硬化性血栓性脑梗死恢复期痰瘀阻络证^[5]及大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤^[6]有很好的治疗和保护作用。鉴于银杏酸的毒副作用，药品注册标准已经对银杏酸进行了严格的含量限定。为了更好地保证银杏二萜内酯葡胺注射液的质量安全，提升质量标准，本文对原料中的银杏酸种类及含量进行了更深入细致地再研究，建立更为灵敏、快速的LC-MS/MS含量测定方法。

1材料

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司）;API4000+质谱仪（美国AB SCIEX公司）;KH2200 B型超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）;HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）;Centrifuge 5424型高速离心机（德国Eppendorf公司）;Mettler AL104型电子分析天平，Mettler XS205型电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司）;Millipore Elix 5纯水仪。

银杏酸C13∶0，C15∶1，C17∶2，C15∶0，C17∶1（上海永恒生物科技有限公司，按峰面积归一化法，纯度>98%）;熊果酸（中国食品药品检定研究院，批号110742-200516）;甲醇（色谱纯，德国Merck公司，批号1728707408）;甲酸（色谱纯，美国ROE SCIENTIFIC INC，批号2B3026）;石油醚（分析纯，南京化学试剂有限公司，批号13070910961）;水为纯化水。

银杏二萜内酯葡胺注射液原料，批号分别为Z121101，Z130701，Z140410，均为江苏康缘药业股份有限公司生产。

2方法与结果

2.1色谱条件

Agilent Zorbax Eclipse plus C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）;流动相甲醇-0.2%甲酸水溶液（95∶5），等度洗脱;流速0.5 mL・min-1;进样量2 μL。

2.2质谱条件

离子源为ESI源;离子源温度（TEM）500 ℃;雾化气（GS1）和辅助气（GS2）为氮气，扫描方式为多反应监测（MRM），负离子模式;用于定量分析的检测离子对为：银杏酸C13∶0，m/z 319.1/275.2（碎裂电压-80 V/碰撞能量-30 eV）;银杏酸C15∶0，m/z 347.2/303.3（-85 V/-36 eV）;银杏酸C15∶1，m/z 345.1/301.2（-85 V/-30 eV）;银杏酸C17∶1，m/z 373.2/329.3（-85 V/-35 eV）;银杏酸C17∶2，m/z 371.2/327.2（-85 V/-30 eV）;内标（熊果酸），m/z 455.4/455.4（-150 V/-5 eV）。此条件下各银杏酸的提取离子流图（XIC图）见图2。

2.3对照品溶液的制备

分别取银杏酸C13∶0，C15∶1，C17∶2，C15∶0，C17∶1对照品适量，精密称定，分别用甲醇配制成质量浓度为10 mg・L-1的对照品储备液;再精密吸取该储备液适量，用95%甲醇配制成质量浓度为40 μg・L-1的混合对照品溶液。

另取熊果酸（内标IS）对照品适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度为50 mg・L-1的储备液;精密吸取100 μL至25 mL量瓶中配制成质量浓度为200 μg・L-1的内标溶液。

2.4供试品溶液的制备

依照2010年版《中国药典》中银杏叶提取物中总银杏酸测定^[4]项下方法进行改进：取本品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）30 mL，称定质量，回流提取0.5 h，放冷，再称定质量，用石油醚（60～90 ℃）补足减失的质量，摇匀，离心，精密量取上清液25 mL，水浴蒸干，用95%甲醇定容至2 mL（含内标100 μL，200 μg・L-1），摇匀，即得。

2.5方法学验证

2.5.1线性关系与定量限（LOQ）、检测限（LOD）取上述混合对照品溶液适量，用95%甲醇依次稀释成终浓度约为0.2，1.0，2.0，5.0，12.0，18.0，36.0 μg・L-1的系列对照品溶液，在拟定的LC-MS/MS条件下测定。以待测物的质量浓度（C，μg・L-1）为横坐标，目标分析物与内标峰面积比（Y）为纵坐标，得其线性回归方程，各待测物的标准曲线方程及相关系数均由AB Sciex Multi Quant 2.1数据处理软件自动计算获得。同时测定各银杏酸的定量限（S/N=10）、检测限（S/N=3），结果见表1。结果表明，5种银杏酸线性关系均良好，定量限为0.10～0.21 μg・L-1，检测限为0.025～0.053 μg・L-1。

2.5.2精密度试验取同一混合对照品溶液（含5种银杏酸质量浓度分别约为2 μg・L-1），分别于1 d内和3 d内连续进样，进行LC-MS/MS分析，记录目标分析物与内标峰面积，计算其比值（A分析物/AIS）及RSD，结果见表2，5种银杏酸与内标峰面积比值的RSD均小于6.0%，表明精密度良好。

2.5.3稳定性试验取同一银杏酸混合对照品溶液及同一供试品溶液（批号Z140410），分别于0，2，4，8，16，24，32 h进行LC-MS/MS分析，进样量2 μL，记录各目标分析物与内标峰面积，计算其比值（A分析物/AIS）及RSD，结果见表2，对照品及供试品溶液中各银杏酸与内标峰面积比值的RSD均小于7.0%，表明对照品及供试品溶液在32 h内基本稳定。

2.5.4重复性试验取同一供试品粉末（批号Z140410）约1.0 g，平行6份，精密称定，按2.4项下

方法平行制备6份供试品溶液，按照上述检测条件进行分析。结果见表2，5种银杏酸含量的RSD均小于15%。根据2015年版《中国药典》“药品质量标准分析方法验证指导原则”征求意见稿中有关“重复性”的规定：当样品中待测成分质量分数为10 μg・kg-1时，重复性的RSD可接受的范围为15%以内。对照分析可知，本方法下5种银杏酸的测定重复性均较好。

2.5.5加样回收率试验取同一供试品粉末（批号Z140410）约0.5 g，精密称定，分别加入对照品溶液（含银杏酸C13∶0，C15∶1，C17∶2，C15∶0，C17∶1的质量浓度分别约为5.0 μg・L-1）1 mL，精密加入石油醚（60～90 ℃）29 mL，其余按2.4项下方法，平行制备6份供试品溶液，按照上述检测条件进样分析，记录各待测物浓度，计算各银杏酸的回收率及RSD，结果见表2，5种银杏酸的加样回收率在73.28%～87.56%，根据2015年版《中国药典》“药品质量标准分析方法验证指导原则”征求意见稿^[7]中有关“准确度”的规定：当样品中待测成分质量分数为10 μg・kg-1时，回收率限度可为70.0%～125%。对照分析可知，本方法下5种银杏酸的测定准确度均较好。

2.6样品含量测定

取3批银杏二萜内酯葡胺注射液原料，按2.4项下方法，制备各批次供试品溶液，按照上述检测条件进样分析，记录各待测物浓度（由AB Sciex Multi Quant 2.1数据处理软件通过标准曲线自动计算获得），并计算样品中银杏酸的含量，结果见表3。

3讨论

3批银杏二萜内酯葡胺注射液原料中所含总银杏酸的质量分数为0.023～0.028 μg・g-1，均远低于药品注册标准规定的2 μg・g-1;以各种银杏酸含量的平均值评价，样品中主要含有的银杏酸为C15∶1（40.9%）和C17∶1（32.1%），其次是C13∶0（17.0%），而C17∶2（5.4%）和C15∶0（4.5%）的平均含量低于总量的10%。

样品前处理过程中，曾考察乙酸乙酯作为提取溶剂，但由于银杏二萜内酯葡胺注射液原料中所含银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K总量大于90.0%，银杏内酯类成分在乙酸乙酯中溶解性极好，乙酸乙酯提取溶液蒸干后的残渣在最终用95%甲醇定容时，会形成银杏内酯类成分的饱和溶液，若直接进样分析可能会造成分析过程中化合物的析出，影响测定，故最终未选用乙酸乙酯提取。

文献报道银杏酸的测定大多采用HPLC^[7-8]，但对于极微量物质测定时该方法灵敏度仍不理想（最低检测限和定量限均为μg级），分析时间周期也较长。有关液相-质谱联用法测定银杏酸的文献报道较少，并且存在诸多问题，比如Karine N等^[9]用LC-MS并采用选择离子监测（SIM）模式测定银杏酸的含量，该模式选择性较差，相同相对分子质量的物质可能干扰测定;Yao X等^[10]采用与本研究相同的MRM模式，选择性更高，但仅测定了2种银杏酸（C13∶0和C15∶1）的含量。本研究采用LC-MS/MS并使用MRM模式，对5种银杏酸的测定进行方法学的研究与验证，取得了比较理想的结果。该方法对银杏叶及其相关制剂中银杏酸的检测，均可提供一定的参考。

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