四君子汤对过敏性紫癜患儿循环内皮祖细胞和肿瘤坏死因子α的影响

[摘要] 目的 探讨四君子汤对过敏性紫癜（HSP）患儿循环内皮祖细胞（EPC）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。 方法 采用随机数字表法将2014年1月～2015年9月于华北石油总医院（以下简称“我院”）儿科门诊确诊的30例HSP患儿随机分为两组：实验组和对照组，每组15例，对照组给予常规治疗，实验组在此基础上加用四君子汤治疗，同时选取我院体检中心体检的15名健康儿童作为正常组。治疗前和治疗后1周，分别检测EPC数量和功能以及血清TNF-α水平。 结果 治疗前实验组和对照组循环EPC数量和TNF-α水平均明显高于正常组（P < 0.01），而EPC功能则显著下调（均P < 0.01）。经治疗1周后，实验组和对照组循环EPC数量、功能和TNF-α水平均有所恢复。相比之下，实验组的恢复程度较对照组更为明显，且与正常组差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 在常规治疗的基础上加用四君子汤能够更快地促进HSP患儿循环EPC和TNF-α的恢复。

[关键词] 过敏性紫癜；内皮祖细胞；肿瘤坏死因子α；四君子汤

[中图分类号] R725.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（a）-0100-04

Department of Examination Center， the General Hospital of North China Oil Field， Hebei Province， Renqiu 062552， China

[Abstract] Objective To assess the effects of Sijunzi Decoction for circulating endothelial progenitor cell （EPC） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in children with Henoch-Sch nlein purpura （HSP）. Methods Thirty children with HSP diagnosed in Department of Pediatrics of the General Hospital of North China Oil Field （"our hospital" for short） from January 2014 to September 2015 were randomly divided into two groups by random number table method： experimental group and control group， with 15 cases in each group. The children in control group were received conventional therapy， and the children in the experimental group were received Sijunzi Decoction， besides conventional therapy. Meanwhile， 15 healthy children from Department of Examination Center of our hospital were selected as the normal group. Before treatment and 1 week after treatment， the number and function of circulating EPC and levels of serum TNF-α were assessed. Results The number of circulating EPC and levels of serum TNF-α were all increased in the experimental group and control group compared with those in the normal group （P < 0.01）， but the function of circulating EPC was down regulated （all P < 0.01）. One week after therapy， the number and function of circulating EPC and levels of serum TNF-α were all recovered in the experimental group and control group. The degree of recovery in the experimental group was more evident than control group， and no difference could be observed in the experimental group and the normal group （all P > 0.05）. Conclusion In addition to conventional therapy in the children with HSP， Sijunzi Decoction can accelerate the recovery of circulating EPC and TNF-α.

[Key words] Henoch-Sch nlein purpura； Endothelial progenitor cell； Tumor necrosis factor-α； Sijunzi Decoction

过敏性紫癜（Henoch-Sch nlein purpura，HSP）是由免疫复合物介导的全身性血管炎性疾病[1]，并且已经成为儿童继发性肾脏疾病的主要原因[2]。尽管发病机制尚不完全明晰，但是，作为血管损伤修复关键因素的内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）[3]以及炎症性细胞因子[4]在HSP发病中的作用已经逐渐被人们所认识，其不仅参与了HSP的发生发展过程，并且与HSP肾损害密切相关。鉴于四君子汤特有的免疫调节作用[5]，本研究在常规治疗的基础上加用四君子汤对HSP患儿进行治疗，并对治疗前后的循环EPC和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）进行了检测，为其临床广泛应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2015年9月于华北石油总医院（以下简称“我院”）儿科门诊确诊的30例HSP患儿为研究对象，所有患儿均以皮肤紫癜、关节肿痛为主要临床表现，经实验室及影像学检查排除相关疾病后确诊为HSP[6]。本次受试患儿中男16例，女14例；年龄2～7岁，平均（4.6±2.1）岁；平均病程（6.5±2.1）d。采用随机数字表法将其分成对照组和实验组，每组15例。其中对照组男8例，女7例；年龄（4.3±1.9）岁；病程（6.7±2.3）d。实验组男7例，女8例；年龄（4.8±2.2）岁；病程（6.4±2.1）d。两组一般资料比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。同时选取于我院体检中心进行健康体检的同龄健康儿童15名作为正常组，其中男8名，女7名，年龄（4.5±2.3）岁，与HSP患儿在性别和年龄上差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，所有患儿家长均知情同意。

1.2 方法

对照组在确诊后即给予马来酸氯苯那敏、山莨菪碱片、西咪替丁、维生素C常规口服治疗，治疗组在此基础上加用四君子汤口服。四君子汤组方为：白术、人参、茯苓各5 g，炙甘草2 g，加清水80 mL文火煎至20 mL，每次口服10 mL，每日2 次，疗程为1周。

1.3 检测指标

清晨空腹经肘正中静脉采集外周血10 mL，分别行相关检测。

1.3.1 血清TNF-α 取外周血3 mL，应用德国Hanau公司Heraeus离心机（离心半径3.0 cm）1500 r/min离心15 min分离血清，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测，应用美国Peprotech公司的TNF-α检测试剂盒并按其说明书操作。

1.3.2 循环EPC数量 取EDTA抗凝的外周血1 mL，以200 μL加入FITC标记的KDR（美国BD公司）、PE标记的CD34（美国BD公司）各5 μL，避光孵育20 min，经红细胞裂解、2%多聚甲醛固定后，应用流式细胞仪检测CD34和KDR双阳性EPC的数量。

1.3.3 循环EPC体外培养和鉴定[7] 取外周血5 mL，应用淋巴细胞分离液（天津TBD公司）分离单个核细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤、离心（离心半径3.0 cm，1500 r/min，离心5 min）2次后，加入内皮细胞培养基-2（EGM-2，瑞士Lonza公司）将细胞密度调整为1×107/mL，并接种至纤维连结蛋白（fibronectin，美国Hematological Technologies公司）包被的24孔板中，在37℃、5%CO2条件下进行细胞培养。第7天通过免疫荧光法对EPC进行检测，方法：加入5 mg/L DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL，美国Molecular Probes公司）培养4 h。吸弃培养基，加入2%多聚甲醛固定15 min，PBS反复洗涤5遍后，加入5 mg/L FITC标记的血凝素（FITC-lectin，美国Sigma公司）0.2 mL，37℃孵育1 h。经PBS反复冲洗后用德国Leica公司的TC-SP激光共聚焦显微镜进行检测。双荧光阳性的细胞即EPC。

1.3.4 EPC增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，经EGM-2重悬并调整为1×105/mL，96孔板每孔加入细胞悬液0.2 mL，37℃、5%CO2条件下培养92 h，加入噻唑蓝（MTT，美国Duchfo公司，5 mg/mL）20 μL继续培养4 h。吸弃培养基，加入100 μL 二甲亚砜，振荡2 min后用美国BIO-RAD公司的Model 680酶标仪检测570 nm处的吸光度（A值）。

1.3.5 黏附能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，经EGM-2重悬并调整密度为5×104/mL，24孔板每孔加入EPC悬液1 mL，在37℃、5%CO2条件下培养30 min。PBS冲洗3遍后，于200×相差显微镜（型号：CKX31，日本Olympus公司）下进行EPC计数。

1.3.6 细胞迁移能力 0.25%胰蛋白酶消化EPC，并用EGM-2培养基（含0.1%胎牛血清，无细胞因子）调整密度为5×104/mL。取0.2 mL加入Trans-well中，并置入含0.6 mL EGM-2培养基的24孔板中，37℃、5%CO2条件下培养24 h。取出Trans-well，去除内层EPC后对外层EPC用2%多聚甲醛固定，经结晶紫染色后在200倍相差显微镜下进行EPC计数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件包进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多个样本之间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；两个样本之间的比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清TNF-α水平

实验组和对照组患儿治疗前血清TNF-α水平均明显高于正常组（P < 0.01），并且实验组和对照组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗1周后，实验组和对照组患儿血清TNF-α水平均有不同程度的下降（均P < 0.01），相比之下，实验组较对照组下降更为明显（P < 0.01），且与正常组之间的差异已无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 循环EPC数量的变化

治疗前实验组和对照组患儿循环EPC数量均明显高于正常组（P < 0.05），并且实验组和对照组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗1周后，实验组患儿循环EPC数量均有不同程度的下降，相比之下，实验组较对照组下降更为明显（P < 0.05），并且实验组治疗前后差异有统计学意义（P < 0.05），而对照组治疗前后差异无统计学意义（P > 0.05）。同时，实验组治疗后与正常组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 循环EPC功能的变化

治疗前实验组和对照组患儿循环EPC体外的增殖、黏附和迁移能力均明显低于正常组（P < 0.01），并且实验组和对照组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗1周后，实验组和对照组患儿循环EPC体外功能指标均有不同程度的改善，其中增殖和迁移能力各组之间差异统计学意义（P > 0.05）。但黏附实验显示对照组仍略低于实验组和正常组（P < 0.05），而实验组与正常组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。3 讨论

HSP是一种以小血管炎为主要病理特征的变态反应性疾病[8]，通常累及毛细血管，造成其渗透性和脆性增加[9]。该病易反复发作[10]，进而造成肾脏的损害[11]。紫癜性肾炎是HSP较为严重且持久的并发症[12]，主要的病理特征为弥漫性的小血管炎及肾间质的损害[13]。通常认为，作为内皮细胞前体的EPC在血管内皮损伤修复及血管新生的过程中发挥着重要的作用。一旦出现急性血管损伤，机体会通过动员骨髓EPC入血，增加循环EPC的数量并促进其归巢至损伤发生的部位，发挥其修复作用[14]。而在HSP的进程中，免疫炎性反应在造成血管内皮损伤[15]的同时，尽管会促进机体循环EPC数量的增加，但同时也会抑制EPC的功能[3]，使其在血管内皮损伤修复上的作用不能得到充分有效的发挥。若该效应反复或持续存在，便会造成紫癜性肾炎的发生。TNF-α作为重要的炎症性因子，可以对体内的免疫反应发挥重要的调节作用。此外，TNF-α还可以直接或协同其他细胞因子作用于肾脏[16]，造成肾脏血流动力学和内皮细胞结构的改变，抑制内皮细胞生长，引起肾小球毛细血管壁通透性的增加[17]。较高浓度的TNF-α还能够诱导血管内皮细胞凋亡和血管壁的损伤[18]，并造成循环EPC功能的下调，从而加重肾脏病变。

四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草组成[19]，具有健脾益气功效，为治疗脾气虚证经典方剂[20]。方中人参补益中气，健脾和胃为君；白术温脾燥湿为臣；佐以茯苓甘淡渗湿健脾，使以甘草养胃和中。全方共奏健脾和胃、益气养血之功效。近来有研究证明四君子汤还具有减轻氧化应激、抑制免疫炎性反应的作用[5]。因此本研究应用四君子汤对HSP进行治疗，正是利用其进行免疫调节，改善免疫功能。本研究结果表明，在HSP的治疗过程中，在常规治疗的基础上加用四君子汤口服，不仅能够更为迅速地抑制体内的免疫炎性反应，减少以TNF-α为代表的炎症性细胞因子的生成和释放，同时循环EPC的各项功能指标也能够更为迅速地上调至正常水平，从而有效地发挥对血管内皮损伤的修复作用。在这样的作用效应背景下，循环EPC在完成受损血管内皮的修复工作后，其在外周血中的数量也就能够更快地回调至正常水平。

由此可见，在常规治疗的基础上加用四君子汤对HSP进行治疗，对于抑制免疫炎性反应和循环EPC异常所造成的血管病变的进展，促进疾病的迅速康复能够起到积极的作用，因此值得在临床中加以推广。然而，值得注意的是，氧化应激和炎性反应是由复杂的、多通路的细胞因子网络构成，同时，对于四君子汤的免疫调节机制及其具体的信号途径，目前尚无相关研究予以明确阐释，四君子汤在对HSP的治疗过程中是通过什么信号通路抑制炎症细胞因子的释放还需要进一步深入研究。

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（收稿日期：2015-12-03 本文编辑：张瑜杰）