高迁移率族蛋白N2对人舌癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究

[摘要] 目的 研究高迁移率族蛋白N2（HMGN2）对人舌癌裸鼠移植瘤生长的抑瘤作用。方法 裸鼠腋下注射接种舌鳞癌细胞Tca8113以建立裸鼠移植瘤模型，接种7 d成瘤后，设立阴性对照组、HMGN2蛋白组和阳性对照组，在瘤体周边分别注射含washingbuffer Ⅱ、HMGN2蛋白和顺铂的细胞培养基。观察各组裸鼠肿瘤的生长情况，经过4次给药后处死裸鼠，取出瘤块，称其质量计算抑瘤率，并行苏木精-伊红（HE）染色观察形态学变化。结果 成功建立舌癌裸鼠移植瘤模型。HMGN2蛋白组和阳性对照组肿瘤体积明显小于阴性对照组。裸鼠体重在整个实验过程

中并没有明显的变化。阴性对照组、HMGN2蛋白组、阳性对照组的肿瘤质量平均值分别为（0.38±0.19）、（0.21±

0.15）、（0.23±0.16）g，3组间的差异无统计学意义。HMGN2蛋白组和阳性对照组的抑瘤率分别为45.71%和39.44%。肿瘤经肉眼观察可见阴性对照组瘤块较大，HE染色可见HMGN2蛋白组和阳性对照组细胞坏死明显。结论 HMGN2蛋白可以明显抑制人舌癌裸鼠移植瘤的生长。

[关键词] 高迁移率族蛋白N2； 移植瘤； Tca8113细胞

[中图分类号] R 730.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.002

Inhibitory effects of high mobility group chromosomal protein N2 on human tongue carcinoma transplanted in nude mice Liu Xiqian， Dong Xiaoqian， Zhang Yonghong， Zhang Ping， Li Xiaoyu， Chen Sixiu， Feng Yun. （State Key Laboratory of Oral Diseases， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Objective To evaluate the inhibitory effect of high mobility group chromosomal protein N2 （HMGN2） on human tongue carcinoma tumor in nude mice. Methods A transplantation tumor model in nude mice was constructed by injecting Tca8113 cells. After a week， negative control groups， masculine control groups， and HMGN2 groups were esta-blished. Cell culture of the three groups were separately injected with washing buffer Ⅱ， cis-dichlorodiamineplatinum （DDP）， and HMGN2 protein. The tumors were moved after four treatments， and then analyzed by hematoxylin-eosin （HE） staining. Results A transplanted tumor model was established successfully. The volumes of HMGN2 groups and masculine control groups were smaller than those of the negative groups. Mouse weight did not differ among the three groups. Average tumor weight of the negative group was （0.38±0.19） g， that of the HMGN2 group was （0.21±0.15） g， and that of the DDP group was （0.23±0.16） g. These factors indicated no statistically significant difference among the three groups. The tumor inhibitory rate of HMGN2 group was 45.71%， and that of the positive group was 39.44%. Based on evaluation by naked eye， the tumor in the negative group was larger than that in other groups. In addition， cell necrosis was observed during HE staining. Conclusion HMGN2 could significantly inhibit growth of the transplanted tumor in nude mice.

[Key words] high mobility group chromosomal protein N2； transplantation tumor； Tca8113 cell

高迁移率族蛋白（high mobility group chromo-somal protein，HMG）是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最丰富的非组蛋白家族，其中，HMGN是一组与核小体结合的白，能够改变染色质的结构，增强染色质模板的转录和复制[1-2]。HMGN2是HMGN家族之一。研究[3]发现，HMGN2具有抗菌活性和抗乙型肝炎病毒活性，提示它作为免疫活性分子在天然免疫防御中有着重要的作用。本研究探讨在裸鼠体内，HMGN2分子对裸鼠舌癌模型的肿

瘤抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料来源

4～6周龄BALB/c裸鼠24只，均为雄性，体重15～20 g，购自四川大学实验动物中心；Tca8113人舌癌细胞株，由四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 HMGN2蛋白的提取 将含有原核表达载体pGEX-HMGN2的大肠杆菌50 ?L接种于含氨苄青霉素的5 mL Luria-Bertani（LB）液体培养基中，于37 ℃、200 r·min-1振荡过夜，然后于含氨苄青霉素的1 000 mL LB培养液中增菌，振荡摇菌6 h，加入终浓度为0.4 mmol·L-1的异丙基硫代半乳糖苷（iso-propyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导过夜，离心收集剩余细菌，每克菌（湿重）中加入含0.4 mmol·L-1苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的3 mL RIPA细胞裂解液，重悬细菌，冰上裂解20 min、超声裂解2 min以裂解细菌，于1.4×104 r·min-1离心20 min，收集上清，用0.22 mm过滤器过滤后，用B-PER GST融合蛋白纯化试剂盒进行纯化，加入5 U凝血酶酶切融合蛋白（酶切条件37 ℃、3 h），酶切后收集HMGN2蛋白，-20 ℃收集保存。

1.2.2 人舌癌裸鼠模型的建立 人舌癌细胞株Tca8113在含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液中于37 ℃、5%CO2条件下常规培养，待细胞长至90%汇合时，收集细胞，在完全RPMI 1640培养基中制备细胞悬液。于24只裸鼠右侧腋下进行Tca8113细胞悬液皮下接种，每只接种0.1 mL（含活细胞数约5×106个），观察成瘤情况，1周后有21只裸鼠形成肿瘤。

1.2.3 实验分组 将21只成瘤裸鼠随机分为3组：阴性对照组（n=7），瘤体周边注射含10 ?g·mL-1 washing-buffer Ⅱ的培养基0.1 mL；HMGN2蛋白组（n=8），瘤体周边注射含10 ?g·mL-1 HMGN2蛋白的培养基0.1 mL；阳性对照组（n=6），瘤体注射含10 ?g·mL-1顺铂的培养基0.1 mL。每只裸鼠均为每3 d给药1次，共4次。

1.2.4 抑瘤效应观察 裸鼠接种肿瘤细胞后，每次给药前称量裸鼠体重，并用游标卡尺测量瘤体长径L和短径W，求出肿瘤近似体积V=1/2×L×W2。第4次给药3 d后处死裸鼠，取出肿瘤组织，称其质量并测量长短径。整个实验中肿瘤长短径共测量5次，统计各组的肿瘤体积和质量的差异，并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=[（阴性对照组平均质量-HMGN2蛋白组平均质量或阳性对照组平均质量）/阴性对照组平均质量]×100%。瘤体在4%多聚甲醛中固定，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，观察组织形态学改变。

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0统计学软件，组间比较采用独立样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 模型建立情况

24只裸鼠有21只成瘤，成瘤率为87.5%。接种7 d后，21只裸鼠的移植瘤均可触及，直径为3～4 mm。实验全程无肿瘤破溃，无裸鼠死亡。

2.2 裸鼠的一般状态及抑瘤情况

实验过程中裸鼠体重和肿瘤体积的变化见表1。治疗前3组裸鼠的体重和肿瘤大小无明显差异（P>

0.05）。治疗期间，HMGN2蛋白组和阳性对照组裸鼠精神状态较好，活动能力较强；而阴性对照组裸鼠精神、活动能力较差。治疗期间，第2次给药后测量表明，HMGN2蛋白组的肿瘤体积明显小于阴性对照组（P

2.3 移植瘤的组织形态学变化

移植瘤的组织形态学变化见图1。肉眼观察：阴性对照组肿瘤块较大，有些出现中央坏死；阳性对照组和HMGN2蛋白组肿瘤块明显较阴性对照组小。HE染色：阴性对照组可见多角形癌细胞，异型性明显，细胞质丰富，细胞核呈圆形或卵圆形，大小各异，核分裂象多见，并可见病理性核分裂，染色质较粗、深染，核仁明显，核浆比例增大；阳性对照组和HMGN2蛋白组都可见较为明显的细胞变性和坏死，可以见到细胞肿胀、液化，质膜破裂，以及核溶解、消失等现象。

3 讨论

HMG蛋白由Goodwin等[4]于1973年在牛胸腺细胞中首次发现，因其在聚丙烯酰胺凝胶中具有高迁移率而得名。HMG蛋白的相对分子质量较小，含量相对丰富，结构简单。Bustin[5]将HMG蛋白分为3类：HMGA，特征性结构域为AT-hook；HMGB，特征性结构域为HMG-box； HMGN，特征性结构域为核小体结合结构域（nuclesosomal binding domain，NBD）。

HMGN2属于HMG家族的HMGN亚家族，相对分子质量量约为9.2×103，共由90个氨基酸残基组成，在结构上含具有杀菌活性的α-跨膜螺旋结构域[6]。HMGN2有抗菌活性和抗乙肝病毒的作用[3]，并在胚胎发育以及器官发生中起着重要作用[7]。目前关于HMGN2的国内外研究大多集中于HMGN2参与免疫反应和DNA复制转录等的作用机制，少见对肿瘤细胞作用的具体研究。在慢性牙周炎、进展性牙周炎、种植体周围炎的龈沟液中发现HMGN2增加，表明HMGN2可能是保护牙龈的一种抗炎反应物[8]。有研究[9]表明，敲除HMGN2基因的DT40鸡细胞经紫外线照射后，所产生的环丁烷嘧啶二聚体在染色质中移除的速率比较低，说明HMGN2可能参与核苷酸修复途径。HMGN2和HMGN1重组体可以抑制依赖三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的染色体重塑，但HMGN2不能直接抑制ATP酶的活性，而是降低其对染色质的亲和力，这也表明HMGN2蛋白可能参与染色质重塑的平衡[10]。另有研究[11]表明，单个核细胞经白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）刺激成为淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine ac-tivated killer cells，LAK）时部分HMGN2由细胞核转移至细胞质，进而分泌到细胞外；而这种活化的LAK有非常强的抗肿瘤活性[12]。由此可以认为，HMGN2可能是LAK的一种效应因子。另有研究[13]发现，HMGN2蛋白的片段可以进入肿瘤细胞的细胞核和肿瘤血管内皮细胞，说明HMGN2可能会有抗肿瘤活性。

裸鼠是研究癌症的病因、发病机制、诊断和防治的常用动物之一。裸鼠由于胸腺分化障碍而先天性无胸腺，导致其缺乏细胞免疫反应。研究[3]证实，HMGN2蛋白可参与天然免疫防御反应，但HMGN2在细胞免疫中的作用尚缺乏研究，故本研究选择裸鼠建立动物模型观察HMGN2蛋白的作用。

本研究采用细胞悬液注射法建立动物模型，将Tca8113细胞悬液接种于裸鼠腋下，具有成瘤率高、操作简单和对动物损伤小等优点。本实验中，接种1周后有21只裸鼠成瘤，剩余3只可能是由于细胞悬液局部浓度较低，或裸鼠的部分免疫能力有差别，故成瘤时间较长，在接种10 d后成瘤。经肉眼观察和HE染色镜下观察均证实建模成功。

经过2次给药后，HMGN2蛋白组的肿瘤体积明显小于阴性对照组，而阳性对照组在第3次给药后肿瘤体积才较阴性对照组明显缩小，这说明HMGN2蛋白在肿瘤发生的早期就可能开始发挥作用。在裸鼠的体重方面，3组之间并没有明显的差别，可能是由于实验的时间较短，使得肿瘤对裸鼠并没有太大的影响。HMGN2蛋白组肿瘤的平均质量明显降低，但可能是由于质量数值较小，所以3组之间的差异并无统计学意义。HMGN2蛋白组抑瘤率达到45.71%，而阳性对照组则为39.44%。通过比较肿瘤的生长体积、质量以及抑瘤率，可以发现，HMGN2蛋白组和阳性对照组肿瘤体积的生长明显低于阴性对照组。

形态学变化上，肉眼观察可见HMGN2蛋白组和阳性对照组的肿瘤较小；HE染色可见阳性对照组细胞坏死较为明显，而HMGN2组细胞坏死也较多，可见坏死细胞的细胞核溶解，嗜碱性减退，死亡细胞的细胞质嗜酸性较强；这些现象说明HMGN2蛋白可以促进细胞坏死。

本实验结果显示，HMGN2蛋白有抑制人舌癌裸鼠移植瘤生长的作用。由于HMGN2蛋白在DNA复制及转录中有一定的作用，并且有抗菌及抗病毒的作用，所以对其抗肿瘤作用机制的进一步研究有助于了解它在肿瘤发生发展中发挥的作用，对于寻找新的抗肿瘤药物有重要的指导意义。

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（本文采编 周学东）