甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体的构建

摘要：将甘蓝型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp反义片段构建到中间载体pCambia2301G中，替换GUS基因，由CaMV35S启动子驱动，形成了反义植物表达载体，命名为pCambia2301G-MYB4A， 并转化到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，为进一步研究甘蓝型油菜MYB4基因家族的功能奠定基础。

关键词：甘蓝型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代谢途径；MYB4基因

中图分类号：S565.4；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3428-03

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。甘蓝型油菜中与苯丙烷代谢途径相关的农艺性状是研究人员长期致力于遗传改良的焦点。经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化[1-3]。另外，油菜种皮栅状细胞层中的色素主要与种皮中类黄酮类物质紧密相关，种皮中类黄酮类物质积累越多，种皮的颜色就越深，积累越少或没有时种皮就呈黄色，即呈现种胚的颜色，从而表现出黄子性状的优质特性[4，5]。

AtMYB4属于拟南芥R2R3-MYB家族的一种新的负调控转录因子，对于植株中抗紫外线类的芥子酸酯类物质的合成具有重要调控作用，该基因在大多数的植物组织中均有表达。研究发现拟南芥AtMYB4基因突变体叶片中芥子酸酯的含量升高，并呈现出比野生型更强的紫外线耐受能力。已报道AtMYB4转录因子调控苯丙烷代谢途径关键酶基因C4H的表达[6-8]。因此，研究MYB4基因有利于阐明甘蓝型油菜苯丙烷类物质合成和相关性状形成的分子机理。本研究通过构建甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体，为研究MYB4基因家族功能，阐明油菜木质素、种皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及质粒 E. coli DH5α、根癌农杆菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表达中间载体pCambia2301G均由重庆市油菜工程技术研究中心保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 试剂 Taq DNA聚合酶、胰蛋白胨、酵母浸出物、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、链霉素（Str）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTPs、琼脂糖、λ DNA/HindⅢ DNA Marker、DL2000 DNA Marker及DNA Ligation Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶购自美国Fermentas公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；质粒提取（小量）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 反义片段的克隆 对本课题组已克隆的甘蓝型油菜MYB4基因家族（MYB4-1至MYB4-4，详细结果待发表）各成员全长序列进行多重比对，根据该基因家族特异的保守区设计引物：FMYB4A（5′-GAGCTCAGAATCAGCCTTCCTGAT-3′）和RMYB4A（5′-GGATCCTCTAGAGATTCGCTACGT-3′），上、下游引物的5′端分别引入了SacⅠ和BamHⅠ酶切位点。以甘蓝型油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与pMD18-T载体连接并测序。

1.2.2 pCambia2301G-MYB4A重组质粒的构建 采用质粒抽提试剂盒提取pMD18-T-MYB4A质粒，分别用BamHⅠ/SacⅠ双酶切pMD18-T-MYB4A质粒和植物表达中间载体pCambia2301G。采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒回收目标片段。将回收的目标片段用T4 DNA连接酶16 ℃连接4 h后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，并用BamHⅠ/SacⅠ双酶切鉴定。

1.2.3 pCambia2301G-MYB4A重组质粒转化根癌农杆菌 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备参照文献[9]，将5 μL重组质粒采用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404，涂布于含有100 mg/L Kan、40 mg/L Rif、20 mg/L Str的LB平板，28 ℃倒置培养2 d，挑取菌落接种于含相同抗生素的LB液体培养基中培养，菌液提取质粒BamHⅠ/SacⅠ双酶切鉴定，将阳性菌保存于-80 ℃。

2 结果与分析

2.1 反义片段的克隆

以FMYB4A/RMYB4A引物、基因组DNA模板，PCR扩增反义片段后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后出现了1条与预期大小相符的目的片段（图1），回收该目的片段后连接pMD18-T载体转化DH5α，挑选单菌落测序验证。

2.2 反义表达植物载体的构建与鉴定

BamHⅠ/SacⅠ双酶切pMD18-T-MYB4A，酶切后产生467 bp的MYB4A目的片段和约2.7 kb的pMD18-T载体骨架条带（图2）。对pCambia2301G质粒同样进行BamHⅠ/SacⅠ双酶切，切去1.9 kb的GUS基因后回收约12 kb的pCambia2301G载体骨架，然后将其与MYB4A目的片段进行连接，得到重组质粒pCambia2301G-MYB4A。pCambia2301G-MYB4A重组质粒转化DH5α，用BamHⅠ/SacⅠ进行双酶切鉴定（图3）。结果表明，反义片段MYB4A已定向克隆到中间载体pCambia2301G中，成功替换其中的GUS基因，形成了反义植物表达载体pCambia2301G-MYB4A，反义片段MYB4A由CaMV35S启动子驱动，后接Nos终止子，形成表达盒。

2.3 pCambia2301G-MYB4A重组质粒转化根癌农杆菌

将构建好的植物表达载体的质粒转化根癌农杆菌LBA4404的感受态后，得到抗Kan+Rif+Str的阳性克隆，参照大肠杆菌克隆子同样的方法进行双酶切（图4）。结果表明，目的片段成功转化进了根癌农杆菌，得到了pCambia2301G-MYB4A工程菌株。

3 小结与讨论

苯丙烷代谢途径中，相关酶基因的启动序列上都含有一些高度保守的顺式作用元件，为某些转录因子的结合位点。因此，可通过调节木质素的合成控制转录因子的表达来抑制多个基因的表达。近来通过对木质素合成相关酶基因的启动子序列分析发现，在PAL、4CL、CAD等基因的启动子序列上都具有一个PAL盒元件，该元件与苯丙氨酸基因的表达调控有关，如MYB和Ntlim1转录因子的结合位点。Tamagnone等[10]、Kawaoka等[11]将这些调控苯丙酸及木质素合成代谢的转录因子基因MYB和Ntlim1正向或反向导入植物中，能同时调节多个相关酶的表达活性，致使植物木质素合成受阻，木质素含量下降。本研究通过对本课题组克隆的甘蓝型油菜MYB4基因（MYB4-1至MYB4-4）进行多序列比对分析，结合相关MYB类转录因子相关文献报道，避开MYB类转录因子共保守结构域，根据MYB4家族蛋白C端高度保守结构域，设计467 bp的反义片段，并构建到中间载体pCambia2301G中，替换其中的GUS基因，由CaMV35S启动子驱动，形成了反义植物表达载体。该载体的成功构建为揭示甘蓝型油菜MYB4基因家族的功能、修饰油菜苯丙烷代谢途径相关的性状如芥子酸、木质素、类黄酮等奠定了基础。

参考文献：

[1] 陈功华，田森林，刘淑艳.黄籽油菜的育种及推广[J].作物研究，2005，19（2）：126-131.

[2] 张子龙，李加纳.甘蓝型黄籽油菜粒色遗传及其育种研究进展[J].作物杂志，2001（6）：37-40.

[3] 刘志文，王 英，傅廷栋，等.甘蓝型黄籽油菜研究进展[J].中国油料作物学报，2005，27（2）：87-90.

[4] TANG Z L， LI J N. Genetic variation of yellow-seeded rapeseed lines（B. napus L.） from different genetic sources[J]. Plant Breed，1996，116（5）：471-474.

[5] GETINET A， RAKOW G. Repression of seed coat pigmentation in Ethiopian mustard[J]. Can J Plant Sci， 1997，77（4）：501-505.

[6] STRACKE R， ISHIHARA H， HUEP G， et al. Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of the Arabidopsis thaliana seedling[J]. Plant J，2007，50（4）：660-677.

[7] JIN H， COMINELLI E， BAILEY P， et al. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis[J]. EMBO J，2000，19（22）：6150-6161.

[8] HEMM M R， HERRMANN K M， CHAPPLE C. AtMYB4： A transcription factor general in the battle against UV[J]. Trends Plant Sci， 2001，6（4）：135-136.

[9] 柴友荣. 植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达[D].重庆：西南农业大学，2003.

[10] TAMAGNONE L， MERIDA A，PARR A， et al. The AmMYB308 and AmMYB330 transcription factors from Antirrhinum regulate phenylpropanoid and lignin biosynthesis in transgenic tobacco[J]. Plant Cell，1998，10（2）：135-154.

[11] KAWAOKA A， EBINUMA H. Transcriptional control of lignin biosynthesis by tobacco LIM protein[J]. Phytochemistry，2001， 57（7）：1149-1157.