时间：2022-06-23 12:58:55
摘要：目的醋酸菌培养条件的优化与醋酸发酵实验。方法通过正交试验确定最佳培养条件，并在优化条件下进行分批发酵。结果优化培养条件为：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，乙醇10%（v/v），pH 5.5，装量50 mL/500 mL，静置培养5 d。在优化条件下，醋酸产量比用普通产酸培养基提高了36.4%。应用于分批发酵试验产酸较高。结论优化培养条件适合醋酸菌生长与醋酸发酵。
关键词：醋杆菌属巴氏醋杆菌；培养条件；正交设计；分批发酵
中图分类号：TS264.2+2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0011-04
Optimization of Culture Conditions for Acetic Acid Bacterium and Batch Fermentation of Vinegar
WU Bin, LI Li, ZHAO Liang-qi
(Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006，China)
Abstract：Objective To optimize culture conditions of acetic acid bacterium and the batch fermentation of Vinegar. Methods The optimum culture conditions were determined by orthogonal experiment and the batch fermentation was performed under the optimum conditions. Results The optimized culture conditions as follows: 10 g/L glucose, 10 g/L yeast extract powder, alcohol=10 %（v/v）, pH 5.5 , culture 5 d quiescently with 50 mL medium in 500 mL flask. The yield of acetic acid increased to 36. 4% compared with the basic acetic acid-producing medium. The yield of acetic acid is high in the batch fermentation. Conclusion The optimized culture conditions were suitable for the growth and fermentation of Acetobacter pasteurianus.
Key words：Acetobacter pasteurianus；culture condition； orthogonal design；batch fermentation
山西老陈醋不仅是具有“绵、酸、香、甜、鲜”独特风味的调味品，还因其富含多种氨基酸、维生素和微量元素而作为保健品得到广泛使用。近年山西醋业发展迅猛，生产规模日渐扩大，生产技术日新月异，促进了山西老陈醋的发展。在食醋生产中，菌种起着至关重要的作用。一株优良的生产菌株能起到提高产量、稳定质量的目的。本实验室从醋醅中分离到一株醋杆菌属巴氏醋杆菌S12，经N+离子注入诱变获得高产突变株SM12-87。对其培养条件进行了优化设计，得出了最佳培养条件。在正交试验对醋酸菌发酵条件掌握的基础上，通过液态分批发酵对优化后的培养条件进行检验。在67 h生产出92.8 g/L的醋酸，乙醇转酸率达到90.08%，极大地缩短了生产周期，减少了成本。
1仪器与材料
1.1材料
山西老陈醋醋醅（由山西老陈醋集团有限公司提供）；醋杆菌属巴氏醋杆菌（Acetobacter past-eurianus）SM12-87（本实验室保存）。
1.2主要设备仪器
全自动式5 L发酵罐（Edison.N.J.，USA）；GC9800型气相色谱仪（上海科创公司）；HQL150B型恒温摇床（中科院武汉科学仪器厂）。
1.3培养基
1.3.1产酸培养基葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH 5.5，分装于500 mL三角瓶，每瓶100 mL，121 ℃灭菌20 min，使用前加入7%（v/v）无水乙醇。
1.3.2发酵培养基葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH 5.5，121 ℃灭菌20 min，冷却至60 ℃以下加入10%（v/v）无水乙醇。
1.4培养条件优化试验[1]
利用正交表L27（313）设计试验，见表1。分析各因素对醋酸产量的影响。
表1因素水平表
D1，D2，D3分别代表50 mL培养基在500 mL三角瓶中以100 r/min振荡培养，150 r/min振荡培养，静置培养。
1.5最佳接种量、培养温度和酒精度的选择
醋酸菌SM12-87在优化培养条件下，以不同接种量、培养温度和乙醇含量进行培养，选择最佳接种量、培养温度和酒精度。
1.6优化培养条件的验证试验
醋酸菌SM12-87在优化培养条件下培养，以优化前的产酸培养基在30 ℃，100 r/min摇床培养3 d作为对照。测定总酸度和乙酸乙酯含量。
1.7检测方法
总酸度的测定：滴定法[2]。
乙酸乙酯测定：气相色谱测定法[3]。
乙醇转酸率计算公式[4]：
还原糖测定：3,5-二硝基水杨酸法[5]。
氨基氮测定：甲醛滴定法[6]。
1.8醋酸菌SM12-87的分批发酵试验[7]
利用优化培养条件配制发酵培养基，用全自动5 L发酵罐进行醋酸分批发酵。
2结果与讨论
2.1培养条件
根据单因子试验，影响醋酸产量的主要因素有：葡萄糖+酵母膏，乙醇含量，pH，溶氧，培养时间。采用L27（313）正交表进行培养条件优化试验。实验结果见表2、表3。
表2 以醋酸产量为检测指标的正交试验直观分析表
由极差分析的R值可以看出，影响产酸的各因素主次顺序为D > E > A> C >B；最佳工艺条件为A2 B1C2 D3 E3。
表3以醋酸产量为检测指标的正交试验方差分析表
**表示影响高度显著；*表示影响显著
F1-0.1（2, 12）＝2.81，F1-0.05（2, 12）＝3.89，
F1-0.01（2, 12）＝6.93
F1-0.1（4, 12）＝2.48，F1-0.05（4, 12）＝3.26，
F1-0.01（4, 12）＝5.41
由方差分析表可见，D对醋酸菌的产酸影响高度显著，A、E对醋酸菌的产酸影响显著， A与B、A与C的交互作用对产酸有一定影响，A与D的交互作用对产酸影响不显著。从方差分析可知，溶氧条件D3对产酸影响非常显著。由此可见，醋酸菌虽然是好氧菌，但过高的溶氧对醋酸菌的生长和产酸都是不利的。
由直观分析表和方差分析表可知最佳工艺条件为：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，乙醇10%（v/v），初始pH值5.5，相对装量50 mL/500 mL，静置培养5 d。
2.2接种量、培养温度及乙醇含量对醋酸产量的影响
醋酸菌SM12-87在优化条件下，以不同接种量、培养温度及乙醇含量静置培养5 d，测定醋酸产量。不同条件对醋酸产量的影响见图1、图2、图3。
接种量/%
图1接种量对醋酸产量的影响
由图1可知，10%的接种量产酸最高，达89.23 g/L。接种量低会延长延滞期，静置培养5 d产酸值达不到最高；接种量过高会导致菌体过早衰老、自溶，产酸值也减少。
温度/℃
图2温度对醋酸产量的影响
由图2可知，30 ℃下培养产酸最高，达91.3 g/L。由此表明30 ℃为醋酸菌SM12-87的最适培养温度。
乙醇含量/%（v/v）
图3 乙醇含量对醋酸产量的影响
由图3可知，在10%的乙醇含量下，醋酸产量最高。说明醋酸菌SM12-87虽然具有很强的耐乙醇能力，但高于10%（v/v）的乙醇含量会抑制该菌生长和产酸，乙醇转化率也会显著降低；当乙醇含量低于10%时，生长速率、产酸速率和酒精转化率都较高，但总酸度相对较低。
2.3优化培养条件的验证
优化前后的培养条件下醋酸和乙酸乙酯产量见表4。由表4可见，正交试验确定的培养条件是可行的。
表4 培养条件优化前后的醋酸和乙酸乙酯产量
2.4醋酸菌SM12-87的分批发酵试验
2.4.1醋酸液态深层发酵将高产突变醋酸菌株SM12-87扩大培养至对数期后期，以10 %的接种量接入发酵罐中，乙醇含量10 %（v/v），调节生长阶段温度为30 ℃～33 ℃，产酸阶段温度为30 ℃，通气量前期和后期为1∶0.1（v/v）/min、中期为1∶0.12（v/v）/min。连续2次测定酸度未上升或下降，发酵结束。
2.4.2分批发酵实验与发酵动力学参数
图4发酵过程主要参数变化曲线
发酵过程主要参数变化见图4。从菌体生长曲线可知，菌体在0～5 h为延滞期，5～15 h为对数期，15～58 h为稳定期，58～67 h进入衰亡期。在对数期，醋酸的增加随菌体的增加而增加；在稳定期，醋酸菌菌体数量不再增加，但醋酸产量继续增加；进入衰亡期产酸逐渐停止。由此可见该菌株合成醋酸是部分生长关联型。此次分批发酵，总酸度达92.8 g/L，乙醇转酸率为90.08%，至发酵结束，平均产酸速率为1.389 g・L-1・h-1。
3讨论
验证实验的结果可以看出，通过正交试验确定的优化培养条件是合理可靠的，满足了该菌株的生理学要求。巴氏醋杆菌是一种耐酒精能力强、醋酸产量高的醋酸菌株，它在10%（v/v）酒精度下生长旺盛，静置培养5 d，总酸度可达91.67g/L。在乙醇含量为10%（v/v）的发酵培养基中液态分批发酵67 h，得到总酸度为92.8 g/L的液态醋。由于产酸速率加快，发酵时间缩短，乙醇挥发减少，酒精转化率达到90.08%，同时也减少了电耗，减轻了劳动量，降低了成本，显示了液态发酵在制醋上的优势。
参考文献
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注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”