MTA1基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

[摘要] 目的 探索MTA1基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系。 方法 以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTA1全长基因的质粒pEGFP-C1/MTA1转染HeLa细胞，应用Western blotting检测转染效果，细胞黏附实验检测细胞黏附能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化，Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 MTA1质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中，MTA1蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组（P＜0.05）。结论 MTA1基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关，MTA1基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点。

[关键词] 转移相关基因1；宫颈癌；肿瘤转移

[中图分类号] R737.33[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2011）20-15-03

The Influence of MTA1 Gene in Invasion and Metastasis of Cervical Cancer

ZHU YimingYANG Zhengyan

Department of Gynecology Oncology，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

[Abstract] Objective To study the relativity between MTA1 and invasion and migration of cervical cancer cells. Methods The plasmid pEGFP-C1/MTA1 inserted by the full length cDNA encoding human MTA1 gene was transiently transfected into HeLa cells by LipofectamineTM2000. The expression of MTA1 protein was investigated by Western blotting. Cell adhesion ability change was detected by cellular adhesive experiment. Migration rate was measured by wound healing assay. Furthermore，the abilities of cell invasion and metastasis were investigated using Transwell chambers. Results The cell adhesion，invasion and migration ability was increased after MTA1 over-expression mediated by pEGFP-C1/MTA1 transfection in HeLa cells（P＜0.05）. Conclusion Over-expression of MTA1 gene significantly increased the cell invasion，migration，and adhesion ability. MTA1 could serve as a potential therapeutic target in cervical cancer.

[Key words] Metastasis-associated 1；Cervical cancer；Tumor migration

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率及病死率呈逐年上升的趋势[1]。侵袭、转移是影响宫颈癌病死率及预后的主要因素[2-4]。研究表明，MTA1在许多肿瘤中都表达上调。MTA1基因属于组蛋白去乙酰基酶（HDAC）家族的一个成分，能够通过改变组蛋白的乙酰化状态进行调控基因的表达，使得一些癌细胞向着更具有侵袭性的表型转化。然而，MTA1在宫颈癌中的研究却极少，因此我们选取了宫颈癌细胞HeLa检测其MTA1的表达情况，并且观察MTA1对其转移、侵袭的影响。

1材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系HeLa购自美国典型物种保存中心（ATCC），置于含10%的胎牛血清、100U/mL链霉素及100U/mL青霉素的DMEM培养基（购自Gibco公司），在37℃、5%CO2培养箱中培养，24h更新新鲜培养基。0.25%胰蛋白酶消化，收集并传代。选取对数生殖期细胞用于实验。羊抗人MTA1多克隆抗体（1200），鼠抗人β-actin单克隆抗体（11000）及二抗IgG（11000）购自Santa Cruz公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，Transwell孔板购自美国Corning公司。PCR纯化试剂盒购自美国Qiagen公司，基质胶购自B.D.公司，PCR引物序列由广州锐博生物公司合成。pEGFP-C1由山东大学分子生物实验室惠赠。

1.2实验方法

1.2.1正义全长MTA1真核表达载体的构建并转染宫颈癌细胞系HeLa根据MTA1基因序列，设计其全长表达引物并进行PCR。提取人宫颈癌细胞系HeLa细胞中的总RNA逆转录成cDNA。PCR扩增条件：94℃变性1min，56℃退火40s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃延伸10min。产物琼脂糖凝胶电泳，PCR纯化试剂盒纯化，与双酶切后的pEGFP-C1载体黏端连接，转化，测序，获得正义表达载体pEGFP-C1/MTA1。MTA1全长表达引物序列如下：上游引物5’-AGCGTCACCCTGCTCAACGAGACCG-3’；下游引物5’-GGTTGGCCTCTGATGCAGACCACTC-3’。pEGFP-C1/MTA1送广州锐博生物公司测序，鉴定为正确序列。按照LipofectamineTM2000说明书操作，将pEGFP-C1/MTA1及pEGFP-C1质粒瞬时转染HeLa细胞，PBS作为空白对照。培养48h后，将细胞分为pEGFP-C1/MTA1组、pEGFP-C1组及对照组进行实验。

1.2.2Western blotting检测Snail蛋白的表达取蛋白质样品上样，以12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离样品，转膜，封闭液室温封闭后加入一抗羊抗人MTA1多克隆抗体（1200）、鼠抗人β-actin单克隆抗体（11000），然后4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记二抗IgG（11000），37℃孵育1h，加入ECL，暗室曝光、显影、定影。

1.2.3细胞黏附能力实验转染48h后，于预铺Matrigel（100μg/mL）的96孔板每孔中加入1×105细胞，设3个平行孔，分别在孵育20、40、60min后用PBS洗涤以除去未黏附的细胞。MTT法检测570nm处的吸光度（A）值。黏附细胞比例（%）=黏附于Matrigel上细胞的A值/总细胞A值×100%。

1.2.4细胞划痕实验转染48h后，将生长状态良好的细胞接种于6孔培养板中，待细胞长到完全融合时，用200μL黄色枪头在6孔板的底面上沿直线轻轻进行划痕，PBS冲洗2次后继续培养，分别与8h、16h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况并照相，以细胞划痕愈合百分比表示细胞的运动能力（0h的细胞划痕愈合为0%）。

1.2.5Transwell小室体外侵袭实验将Transwell小室置于24孔板内，每个孔下室内加入10%小牛血清的DMEM培养液500μL，上室加入200μL细胞悬液，每组设5个复孔，常规培养12h。取出Transwell小室，95%乙醇固定，棉拭子擦去小室内面的基质胶，4%多聚甲醛固定，HE染色，显微镜下观察并照相。

1.3统计学处理

实验数据均经SPSS13.0统计软件处理，结果以（χ±s）表示，两组之间均数的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1转染pEGFP-C1/MTA1后MTA1蛋白表达的改变

转染后，pEGFP-C1/MTA1组MTA1蛋白的表达明显高于pEGFP-C1组及对照组（P＜0.05），pEGFP-C1组和对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。各组的相对表达量见表1。

2.2细胞黏附能力检测

细胞黏附能力实验结果显示细胞种植30min后黏附率pEGFP-C1/MTA1组明显高于pEGFP-C1组及对照组（P＜0.05），pEGFP-C1组和对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞种植30min后黏附率见表1。

2.3单层细胞划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力

单层细胞受伤的24h内只能靠细胞的移动来愈合，所以单层细胞划痕实验可以反映细胞的迁移能力。单层细胞划痕实验显示，pEGFP-C1/MTA1组细胞的迁移速度明显快于pEGFP-C1组及对照组（P＜0.05），pEGFP-C1组和对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。各组细胞的划痕愈合百分比见表1。

2.4细胞侵袭能力的比较

Matrigel胶能在聚碳酸酯微孔滤膜表面形成类似基底膜的结果，所以细胞穿过Matrigel的情况可以反映出肿瘤细胞的侵袭能力。Transwell侵袭小室实验结果显示，pEGFP-C1/MTA1组穿膜细胞数明显多于pEGFP-C1组及对照组（P＜0.05），pEGFP-C1组和对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。各组的穿膜细胞数见表1。

注：MTA1蛋白的表达：pEGFP-C1组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=2.087，P＜0.05，对照组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=2.081，P＜0.05；细胞黏附率：pEGFP-C1组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=1.067，P＜0.05，对照组与pEGFP-C1/MTA1组比较 t=1.054，P＜0.05；细胞划痕愈合百分比：pEGFP-C1组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=2.101，P＜0.05，对照组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=2.091，P＜0.05；穿膜细胞数：pEGFP-C1组与pEGFP-C1/MTA1组比较t=1.661，P＜0.05，对照组与pEGFP-C1/MTA1组比较 t=1.597，P＜0.05

3讨论

MTA1基因是Toh等运用差异cDNA文库扫描技术从高转移大鼠乳腺腺癌细胞系中发现的，随后用同源的方法发现了人的MTA1基因。除外的正常组织中，如心脏、肝脏、脑、肺脏、肾脏中MTA1都呈低水平表达，说明MTA1基因参与了正常细胞的增殖过程。近年来研究发现，MTA1在多种恶性肿瘤组织中过表达，并且过表达的癌组织具有明显的高侵袭率和淋巴结转移率，容易发生血行转移[5，6]。符丽华等[7]运用RT-PCR检测了53例新鲜宫颈癌组织标本，发现宫颈癌组织MTA1 mRNA表达量明显增高，并且与宫颈癌的临床分期及转移有关。但是目前在分子水平有关MTA1与宫颈癌细胞转移浸润的研究鲜有报道。

本实验选取了宫颈癌HeLa细胞为研究对象，对其转入全长正义MTA1质粒进行干预，结果发现pEGFP-C1/MTA1组MTA1蛋白的表达较pEGFP-C1组和对照组明显增强，并且pEGFP-C1/MTA1组较pEGFP-C1组和对照组细胞黏附率高、划痕愈合能力强、穿膜细胞数多，说明pEGFP-C1/MTA1组在异质间黏附能力、侵袭转移能力方面均明显增强，这与MTA1在其他恶性肿瘤中的研究结果一致。目前MTA1增强肿瘤细胞侵袭转移能力的具体机制尚不明确，但是明确的是MTA1蛋白能够与组蛋白去乙酰化酶结合，去除组蛋白的乙酰基从而重塑染色质的结构，因此MTA1能够直接或者间接地作用于某些抑制肿瘤浸润转移的基因，下调其转录从而促进肿瘤的浸润转移。

本研究中我们证实了MTA1与宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移能力的关系，为宫颈癌分子转移机制提出了理论依据，并且为宫颈癌的靶向治疗提供了新的参考靶点。

[参考文献]

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[7] 符丽华，熊小英. MTA1基因在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J]. 中国妇幼健康研究，2006，17（5）：349-351.

（收稿日期：2011-05-09）

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