安徽乌菜SRAP技术体系的优化

摘 要： 以合肥黄心乌为试材，利用正交试验设计，对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+ 浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度和模板DNA浓度进行5因素4水平的筛选分析，用me3-em3引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系。结果表明，安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为：10×PCR buffer 1 μL，Mg2+ 3.0 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，引物 各 0.5 mol·L-1，模板DNA 4.0 ng·μL-1，Taq聚合酶0.05 U·μL-1，总体积为10 μL。利用此反应体系对安徽乌菜进行PCR扩增并电泳检测，其结果清晰、稳定、可靠，可用于安徽乌菜的遗传分析。

关键词： 安徽乌菜； SRAP； 正交； 体系优化

安徽乌菜是安徽省的著名特产蔬菜之一，起源于南北气候区之间，对研究白菜类的进化与分化可提供有价值的线索[1]。同时，安徽乌菜具有很多优良性状和独特的商品性，如抗寒性、抗病性、耐抽薹、叶面泡皱、口感与风味等，对作物遗传改良具有重要的利用价值。加快安徽乌菜的分子生物学研究是今后进行乌菜种质资源深度开发和利用以及遗传改良的重要保障。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）标记是2001年由美国Li和Quiros[2]发展的一种基于PCR反应的分子标记技术，其多态性丰富、重复性好、操作简便快速、高共显性、在基因组中分布均匀、易测序以及不需预知物种序列信息的优点，使其使用成本相对较低。目前，在多种园艺作物上都建立了SRAP技术体系[3-13]。本研究利用正交试验设计对安徽乌菜SRAP反应体系进行优化，以期得到安徽乌菜的SRAP最佳反应体系，从而为今后的安徽乌菜分子生物学研究提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料由安徽省农业科学院园艺研究所收集提供（表1），其中合肥黄心乌用作体系优化，其他均用作体系验证。2011年8月在安徽省农业科学院园艺研究所试验地播种。试验使用PCR扩增仪为英国 Techne公司TC-512型。PCR反应的Mg2+、dNTPs、PCR-buffer、Taq聚合酶均购自上海生工生物工程技术有限公司。引物设计参照Li和Quiros发表的引物序列[2]，由上海英俊生物工程技术有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 取安徽乌菜的幼嫩叶片，采用Liu等[14]改良CTAB法提取基因组DNA。1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定DNA浓度，用1×TE缓冲液稀释至20 ng·μL-1用于扩增分析。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系优化 采用L16（45）正交试验设计，从影响PCR反应较大的Mg2+浓度（分别为2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1）、dNTPs浓度（分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mmol·L-1）、引物浓度（分别为0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）、Taq聚合酶浓度（分别为0.05、0.07、0.09、0.11 U·μL-1）和模板DNA浓度（分别为2.0、3.0、4.0、5.0 ng·μL-1）5个因素4个水平对乌菜SRAP反应体系进行优化，用me3（5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'）-em3（5'GACTGCGTACGAATTGAC-3'）引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系每处理2次重复。体系的各因素浓度水平和正交设计见表2。

1.2.3 SRAP-PCR反应程序 PCR反应在TC-512 PCR扩增仪上进行：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共5个循环；94 ℃ 变性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃ 保存。

1.2.4 PCR扩增产物的电泳与检测 扩增产物在6% 聚丙烯酰胺凝胶上电泳：60 V功率预电泳30 min，扩增产物加3 μL体积的溴酚蓝上样缓冲液后点样，于120 V恒压电泳90 min左右，待溴酚蓝电泳至胶板2/3处停止电泳。银染检测：10% 的乙醇溶液、0.5% 乙酸溶液固定15 min，0.2% AgNO3溶液染色15～20 min，蒸馏水快速漂洗2次；1.5% NaOH溶液、0.4% 甲醛溶液、1% Na2S2O3 0.33 mL·L-1显色至谱带清晰时停止，蒸馏水漂洗凝胶2～3 min，进行拍照、分析。

1.2.5 SRAP-PCR优化体系的验证 采用SRAP-PCR已优化的反应体系，对37份安徽乌菜材料DNA进行扩增，以验证该体系的效果。

2 结果与分析

2.1 SRAP-PCR扩增反应体系的确立

试验结果表明，16个组合中，由于Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物和模板DNA等5个影响因素浓度组合的不同，扩增结果存在着明显的差异（图1）。组合10扩增效果最佳，条带丰富、清晰、稳定。组合1、5、6、9、11、13、14、15、16扩增的条带较弱，扩增的效果较差；组合7、8扩增的条带背景较深；组合2、3、4、12虽然条带清晰，但条带数相对较少，重复性稍差。由图1可知，在正交组合范围内，安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为：10×PCR buffer 1 μL、Mg2+ 3.0 mmol·L-1、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.5 μmol·L-1、模板DNA 40 ng·μL-1、Taq聚合酶0.05 U·μL-1，反应体系的总体积为10 μL。

2.2 最佳反应体系的稳定性检验

应用上述最佳反应体系，用me2（5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′）-em6（5′GACTGCGTACGAATT GCA-3′）引物组合对37份安徽乌菜DNA进行SRAP扩增，结果见图2。引物对每份DNA样品均扩增出清晰的条带，并且表现出较好的多态性，说明该体系稳定可靠，能够满足安徽乌菜基因组DNA的SRAP扩增要求，应用于安徽乌菜的遗传分析是可行的。

3 讨 论

SRAP标记是针对开放阅读框（ORFs）进行扩增的，因不同个体和物种的启动子、内含子与间隔长度不同而产生多态性。不同作物的SRAP-PCR反应体系往往是有很大差异的，本研究采用正交优化设计方法建立了可用于安徽乌菜遗传相关研究的SRAP体系，相比较单因素筛选优化，减少了处理组合，节省了人力和财力，能更快速的获得满意的试验结果。

在优化SRAP反应体系过程中，由于不同作物基因组差异和所用药品仪器不同，PCR反应体系中各因素最适用量存在一定的差异。本研究针对安徽特有蔬菜品种乌菜进行了SRAP系统优化研究，主要对反应体系中各因素浓度对结果影响进行了探讨。结果表明，各因素对扩增反应结果均有不同影响，其中以Mg2+浓度和dNTPs浓度影响最大。低Mg2+浓度下，扩增条带较模糊，随着Mg2+浓度的增加，扩增条带逐渐清晰；在低Mg2+浓度下，随着dNTPs浓度的增加，扩增条带逐渐增多，且条带颜色逐渐加深；当Mg2+浓度大于3.0 mmol·L-1时，增加dNTPs浓度变化不大；在低dNTPs浓度下，增加Mg2+浓度，扩增条带增加，而在高的dNTPs浓度下，增加Mg2+浓度不能明显增加扩增条带；引物浓度在0.2～0.5 μmol·L-1之间扩增条带无明显差异，但在低引物浓度下，扩增条带颜色较浅，随着浓度的增加，扩增条带颜色逐渐加深；Taq DNA聚合酶浓度和模板DNA浓度在反应体系中对扩增结果影响较小，在一定范围内几乎无差异，主要是通过与其他因素互作而影响扩增效果（图1）。单晓政等[9]对不结球白菜SRAP反应体系进行优化，确立了适合不结球白菜的SRAP反应体系，相比之下，本研究结果除了在dNTPs用量上相同外，其余均有差异，这与李媛等[6]结论一致，即在今后其他十字花科作物的SRAP体系优化工作中，可以对Mg2+、引物及其DNA浓度方面进行重点优化。

本研究利用优化的SRAP反应体系对37份不同的安徽乌菜资源进行分析，结果表现为多态性丰富、稳定性好、重复性好等特点，说明该体系适合于安徽乌菜的遗传分析，这可为今后安徽乌菜种质遗传改良研究提供参考。

参考文献

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