活化转录因子3、4和ki―67在皮肤鳞癌中的表达意义

・基础研究・ ・论著・

活化转录因子3、4和ki-67在皮肤鳞癌中的表达意义

李 春，周为军，宋朝辉，李朝阳，余 萍，曾学文，郭智龙

（新疆自治区人民医院整形外科 新疆 乌鲁木齐 830000）

[摘要]目的：探讨活化转录因子3、4和ki-67在皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达及其临床意义。方法：从笔者所在医院病理科储存的蜡块中随机选择96例皮肤鳞癌和118例基底细胞癌标本，采用免疫组织化学方法检测组织中活化转录因子3、4和ki-67的表达，分析其表达意义。结果：活化转录因子3、4在皮肤鳞癌中的表达较基底细胞癌高，差异有统计学意义（P值分别为0.003和0.001）。Ki-67在两种皮肤癌中的表达无显著差异（P值为0.718）。ATF3、4的表达强度和皮肤鳞癌分化程度成正相关，即分化程度低越低，表达强度越高（r=0.395 P=0.000和r=0.303 P=0.001）。结论：活化转录因子3、4可以作为鉴别皮肤鳞癌和基底细胞癌可靠的蛋白标记物和皮肤鳞癌恶性程度及预后的判断指标。

[关键词]皮肤鳞癌；基底细胞癌；免疫组化；活化转录因子3、4；ki-67

[中图分类号]R730.261 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）12-0040-04

The expression meaning of activating transcription factor 3，activating transcription factor 4 and ki-67 in skin squamous cell carcinoma

LI Chun，ZHOU Wei-jun，SONG Zhao-hui，LI Zhao-yang，YU Ping，ZENG Xue-wen，GUO Zhi-long

（Department of Plastic Surgery，Xinjiang Autonomous Region People’s Hospital， Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To discuss the expression of activating transcription factor 3，activating transcription factor 4（ATF3，4）and ki-67 in skin squamous carcinomas and basal cell carcinomas and their clinical significances. Methods Using immunohistochemical method to detect ATF3，4 and ki-67 expression in 96 cases of skin squamous carcinoma and 118 cases of basal cell carcinoma tissues，which were randomly selected from the hospital preserved in pathology department，then analysis the meaning of expression. Results ATF3，4 in skin squamous carcinomas is higher than that in basal cell carcinomas，the differences were statistically significant（P=0.003 and 0.001， respectively），but there was no difference for ki-67（P=0.718）.Positive correlation could be found between ATF3，4 expression strength and skin squamous cell carcinoma differentiation（r=0.395，P=0.000；r=0.303，P=0.001，respectively）. Conclusion ATF3，4 may be used as the reliable differential protein markers between skin squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma，and they be seen as malignant degree and prognosis indexes of cutaneous squamous cell.

Key words：squamous cell carcinoma；basal cell carcinoma；immunohistochemical method；activating transcription factor 3，4；ki-67

皮肤鳞癌和基底细胞癌是最常见的两种皮肤肿瘤，二者鉴别诊断主要依靠病理组织学。除此之外，临床最常用的辅助诊断方法通常选择免疫组化染色。而现有的常用蛋白标志物不足以起到有效的鉴别诊断作用。因此，尤其在病理诊断有困难的情况下，需要可靠的蛋白标志物来帮助正确区分这两类皮肤肿瘤，提高诊断水平。

活化转录因子3、4（activating transcription factor 3、4，ATF3、4）是活化转录因子家族成员，在正常组织中表达较少，在一些肿瘤组织细胞中高表达。但在皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达、意义报道较少，作用机制不甚明确。Ki-67是临床上检测细胞增殖的常用指标之一。本文采用免疫组化染色的方法研究ATF3、4和ki-67皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达及临床意义。

1 材料和方法

1.1 病例资料

从笔者所在医院院病理科储存的蜡块库中选择皮肤鳞癌和基底细胞癌手术切除标本。纳入标准为病理诊断为皮肤鳞癌和基底细胞癌的患者，无年龄、性别、种族、病损部位限制。排除标准：同一疾病复发再次手术患者；器官移植后发生皮肤肿瘤患者。通过调阅病案资料发现，2008年1月-2014年2月，笔者所在医院住院患者中（整形科、皮肤科）符合纳入和排除标准、确诊为皮肤鳞癌和基底细胞癌各有658和877人次。其中皮肤鳞癌根据鳞状细胞分化程度分为高、中、低分化皮肤鳞癌。根据住院号按顺序编号，利用随机数字表随机选择皮肤鳞癌96例、基底细胞癌118例。两组患者年龄、性别、病损部位无统计学差异。

1.2 主要试剂

兔抗人ATF3、4、ki-67抗体（ 美国Abcam公司，编号分别为ab176872，ab31390，ab66155）、SP试剂盒（含二抗、DAB显色剂，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 免疫组化染色

石蜡包埋组织4μm连续切片，常规37℃烘烤30min，后二甲苯、乙醇脱蜡、水化，3%过氧化氢溶液浸泡10min，阻断内源性过氧化物酶活性。ATF3、4采用高温抗原、EDTA修复20 min，缓慢复温至室温水洗后PBS清洗3次，每次3 min，正常血清封闭15 min后加一抗（ATF3浓度为1：200；ATF4浓度为1：150；ki-67浓度为1：100），4℃过夜，PBS清洗3次，每次3 min。加生物素标记二抗，37℃孵育15 min，PBS洗涤3次，每次3 min；加DAB显色剂，苏木精复染，乙醇脱水，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。

1.4 判断标准

ATF3定位于胞核和（或核仁），ATF4定位于胞浆，阳性染色均为棕黄至棕褐色颗粒。每张切片在×400高倍视野下随机选择4个视野，计数阳性细胞数。采用阳性细胞比例和着色强度两项综合评定阳性结果，（0～+）不着色或淡黄色或阳性细胞数50%。Ki-67抗原的表达主要定位于细胞核， 阳性染色均为棕黄至棕褐色颗粒。不着色或阳性细胞数

1.5 统计学方法

应用 SPSS17.0 统计软件包分析。对于ATF3、4和ki-67在皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达差别，运用Mann-Whitney Test进行假设检验。ATF3、4表达强度与皮肤鳞癌分化程度相关性，用Spearman秩相关系数描述并进行t检验。检验水准均为 0.05（双侧），P

2 结果

2.1 阳性表达结果

ATF3、ki-67阳性表达定位于细胞核和（或）核仁，ATF4阳性表达定位于胞浆，均呈淡黄色至棕黄色（图1）。

2.2 结果统计

皮肤鳞癌中ATF3着色细胞>10%占78%，相对表达强度在++及以上占53%。基底细胞癌中ATF3的表达情况与此迥然不同，ATF3着色细胞>10%占61%（其中25%由向鳞状细胞分化型构成），相对表达强度在++及以上占62%左右（其中27%由向鳞状细胞分化型构成）。ATF3在皮肤鳞癌和基底细胞癌中阳性表达细胞数和相对表达强度都有统计学差异（z=-3.014，P=0.003和z=-2.099，P=0.036）。类似的结果在ATF4中也可见到（z=-3.197，P=0.001和z=-2.276，P=0.023）。且ATF3、4的表达强度和皮肤鳞癌分化程度成正相关，即分化程度低越低，表达强度越高，r=0.395，P=0.000和r=0.303，P=0.001，（表2、3）。

2.3 统计学分析

Ki-67在皮肤鳞癌和基底细胞癌中阳性表达细胞数和相对表达强度无统计学差异，z=-0.362，P=0.718和z=-0.184，P=0.0.854，（图2～4）。

3 讨论

ATF3、4是ATF/CREB亚家族的成员之一，在正常组织中较少表达，而在细胞发生应激事件时较高表达。ATF3、4是应激早期快速反应基因，在一系列损伤性应激信号如：缺氧、DNA 损伤、内质网应激等情况下，ATF3、4基因在体内外会被快速诱导表达[1-4]。有许多研究显示，ATF3、4在多种肿瘤中被检测到异常表达，并且与肿瘤发生发展相关。但其确切的机制尚不甚明了。

笔者纳入的病例中，60%～70%以上的病损位于头面颈部（表1）。基底细胞癌的发病与紫外线辐射有关，但它起源于毛囊干细胞，发病与皮脂腺关系更密切，故基底细胞更常见于头面部（约80%）等皮脂腺丰富的部位。鳞状细胞发病除与紫外线辐射有关外，还与各种长期的不良刺激有关确（如温热、化学刺激、HPV感染等等），一般鳞状细胞癌发生于有皮肤病变的基础上，所以鳞状细胞癌头面部发生与下肢发生的比例大致相当。最近的研究提示，紫外线A致癌可能与其能活化核因子E2相关因子2（NRF2）有关，NRF2能直接结合于ATF3启动子从而增强其表达[5]。

有研究发现，基底上皮细胞过度表达 ATF3 的转基因小鼠，会出现表皮增生，并且会有患口腔癌、基底细胞瘤和乳腺癌的风险[6]。但在笔者的研究中，基底细胞癌阳性表达ATF3较皮肤鳞癌明显偏低。与本研究结果类似，Rose等通过免疫组化染色发现ATF3在皮肤鳞癌中的表达较基底细胞癌、脂溢性角化病、结节性痒疹高，故ATF3可用做区分皮肤鳞癌和其他皮肤增生性疾病[7]。然而，ATF3、4在皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达差异，提示二者发病机制中的某些分子事件可能不完全相同，目前尚无相关基础研究的证据报道。

ATF3、4有促进肿瘤转移作用。ATF3在皮肤转移性鳞癌中高表达提示它可能与肿瘤的恶性生物学行为有关[8]。在前列腺癌中也证实了肿瘤转移抑制基因Drg-1是通过下调ATF3的表达发挥作用的[9]。虽然ATF3促进肿瘤转移的机制不甚清楚，但是其表达可以增强肿瘤细胞活力和侵袭力。笔者观察到，在多数表达ATF3、4活性的基底细胞癌病例中，同时表现出鳞状细胞分化特点，这个特点被认为与基底细胞癌的转移行为相关[10-11]。然而，由于转移性皮肤鳞癌和基底细胞癌相对少见，无随访资料，笔者缺乏相关支持这种观点的证据。在笔者的研究中，所有具有ATF3、4活性的病例没有表现出侵袭性生物学行为。

ATF3、4在皮肤鳞癌中同时升高，且二者的表达强度和分化程度成正相关，即分化越低，表达越高，其机制可能与ATF4-ATF3-p53这一级联模式有关。ATF4也是内质网应激诱导ATF3生成过程中所必需的因子[12]，另一研究发现缺氧可以不依赖HIF的方式诱导ATF3的生成[13]。ATF3是一个转移相关因子，它可能参与到ATF4对于下游靶点的作用中。近年来有研究报道p53可参与线粒体呼吸的调节作用[14]。ATF3可增加p53稳定性，同时也能抑制p53的功能。最近的研究也持类似的观点，认为ATF3能通过抑制P53表达后激活Stat3磷酸化促进皮肤癌增殖从而促进癌症发生[15]。

Ki-67是近年临床上常用的检测细胞增殖的指标之一。无论正常细胞株或肿瘤细胞株，其抗原性的表达随细胞周期的进展而增加，它在G0期和G1早期不表达，G1中期到后期始出现表达，S期到后半期增加明显，G2/M期达高峰，其在细胞分裂后迅速降解或丢失，它的表达是细胞处于分裂期的标志，其表达高低反映细胞增殖的程度可以准确反映细胞增殖的情况。笔者发现ki-67在皮肤鳞癌和基底细胞癌中的表达无明显差异，但其具体机制不明。

总之，实验结果有力地支持笔者的假设：ATF3、4可以作为鉴别皮肤鳞癌和基底细胞癌的新的蛋白标记物和皮肤鳞癌恶性程度及预后的判断指标。而体外及动物模型的相关研究，可为笔者进一步揭示其在皮肤鳞癌中表达的意义提供参考

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[收稿日期]2015-04-11 [修回日期]2015-06-09