二甲基亚砜对高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞的生长影响

[摘要] 目的 初步探讨二甲基亚砜（DMSO）对正常与高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）生长、形态的影响。方法 根据细胞培养基中葡萄糖含量及DMSO浓度的不同，采用成组设计方法随机将细胞分为NG组（给予葡萄糖浓度为5.6 mmol/L低糖DMEM完全培养基）、MG组（给予甘露醇浓度为25 mmol/L DMEM完全培养基）、高糖组（HG，给予葡萄糖浓度为25 mmol/L DMEM完全培养基）、DMSO+NG组（给予含0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5% DMSO的低糖DMEM培养基）、DMSO+HG组（给予含0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%DMSO的高糖DMEM培养基），以细胞存活率为考察指标，采用MTT法检测不同处理组细胞活力。 结果 与NG组比较，当DMSO终浓度大于0.5%时，DMSO+NG组细胞形态改变，细胞活力有显著性变化，差异有统计学意义（P < 0.01）。与HG组比较，当DMSO终浓度大于0.1%时，DMSO+HG组细胞形态改变，细胞活力发生极显著性变化，差异有统计学意义（P < 0.01）。在0.5%～2.5%浓度范围内，DMSO+NG组与含相同体积的DMSO+HG组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。DMSO对正常生长环境下细胞的半数抑制率为2.402%，对高糖刺激条件下细胞的半数抑制率为2.114%。 结论 基于DMSO对高糖刺激下大鼠RMCs细胞影响更为敏感，可为DMSO作溶剂进行同类体外活性筛选提供一定参考。

[关键词] 二甲基亚砜；肾小球系膜细胞；MTT法；高糖

[中图分类号] R962 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（b）-0014-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of dimethyl sulfoxide （DMSO） on growth and morphology in rats' renal mesangial cells （RMCs） in high glucose and normal medium. Methods According to the concentration of glucose and DMSO in the cell culture medium and using the method of group design， the cells were randomly divided into NG group （the concentration of glucose was 5.6 mmol/L）， MG group （the concentration of mannitol was 25 mmol/L）， high glucose group （HG， the concentration of glucose was 25 mmol/L）， DMSO and NG group （the concentration of DMSO was 0.1%， 0.5%， 1%， 1.5%， 2.0%， 2.5%， 3.0% and 3.5% in the normal group） and DMSO and HG group （the concentration of DMSO was 0.1%， 0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， 2.5%， 3.0% and 3.5% in the high glucose group）. Cell viability was selected as evaluation index and carried out with colorimetric assay with MTT. Results Compared with NG group， when the DMSO concentration was higher than 0.5%， the morphous of DMSO and NG group cells changed and the cell viability had statistical difference （P < 0.01）. Compared with HG group， when the DMSO concentration was higher than 0.1%， the morphous of DMSO and HG group cells changed and the cell viability had statistical difference （P < 0.01）. DMSO and HG group had significant difference compared with DMSO and NG group， which had same concentration of DMSO， when the concentration of DMSO was changed between 0.5% and 2.5% （P < 0.01）. The half of the inhibition of DMSO for normal cells was 2.402%， and for cells induced by high glucose medium was 2.114%. Conclusion Based on the fact that the cells induced by high glucose medium were more sensitive， it can provide reference for DMSO as a solvent mediator to the similar activity screening in vitro.

[Key words] Dimethylsulfoxide； Renal mesangial cells； MTT assay； High glucose

细胞培养技术是一种重要筛选手段，可以直接观察活细胞形态结构与生命活动，广泛用于药物体外活性筛选。中药提取物成分复杂，理化性质存在差异，某些成分水溶性较差，一定程度上影响体外评价。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）作为难溶性药物助溶剂与细胞冷冻保护剂[1-3]，能够解决水溶性差化学成分的溶解问题；DMSO同时对细胞生长产生一定影响，量效关系随细胞种类或细胞生长环境产生不同影响[4-6]。本研究不同浓度DMSO对大鼠肾小球系膜细胞及高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞生长影响，旨在寻找合适DMSO浓度范围，降低DMSO对大鼠肾小球系膜细胞（Rats'renal mesangial cells，RMCs）生长影响，提高实验结果准确性与可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠RMCs购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 试剂

DMEM（低糖）培养基（美国Hyclone公司）、DMEM（高糖）培养基（美国Hyclone公司）、青链霉素混合液（100X）（北京Solarbio科技有限公司）、葡萄糖（上海源叶生物科技有限公司）、甘露醇（上海源叶生物科技有限公司）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（北京Solarbio科技有限公司）、二甲基亚砜（DMSO）（北京Solarbio科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京Solarbio科技有限公司）、“四季青”胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。

1.3 仪器

洁净工作台（SW-OJ-2F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（0812K2073CE，力康发展有限公司）、低速离心机（22331Hamburg，德国Eppendorf AG）、倒置显微镜（ECLIPSE TS100-F，日本Nikon公司）、高压蒸汽灭菌器（MLS-3750，日本SANYO公司）、HW-200S离体肠管恒温装置（HW-200S，成都泰盟科技有限公司）、Haier超低温保存箱、实验室超纯水器（UPT-I-100L，成都优普电子产品有限公司）、多功能读板机（SpectraMax M5，美国Molecular Devices公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 RMCs培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中，青链霉素混合液浓度为100 U/mL，于37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育，次日显微镜下观察，1～2 d更换培养液。

1.4.2 细胞分组 根据细胞培养基中含有的葡萄糖的浓度以及DMSO体积分数的不同，根据成组设计原理，随机将细胞分为NG组、MG组、高糖组（HG）、DMSO+正常组（DMSO+NG）、DMSO+高糖组（DMSO+HG），具体分组如下。

NG组：给予低糖DMEM培养基，葡萄糖浓度为5.6 mmol/L；

MG组：给予含25 mmol/L甘露醇培养基；

HG组：给予高糖DMEM培养基，葡萄糖浓度为25 mmol/L；

DMSO+NG组：给予含不同体积分数DMSO的低糖DMEM培养基（体积分数分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）；

DMSO+HG组：给予含不同体积分数DMSO的高糖DMEM培养基（体积分数分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）。

1.4.3 MTT法检测细胞活力 显微镜下观察细胞，细胞融合面积达80%左右时，移去培养液，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化，1000 r/min离心3 min，加入适量培养基混悬细胞。计数板计数，培养基稀释制成密度为5×104个/mL细胞混悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，37℃、5% CO2培养24 h。次日更换为无血清培养基同步24 h，按照“1.4.2”项下方法给予细胞不同处理，每组5个复孔，培养箱孵育24 h。每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，培养箱中孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO溶液，培养箱孵育15 min，震荡10 min，酶标仪490 nm处测定每孔吸光度，重复3次，取均值。按公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组/对照组×100%

1.4.4 细胞形态学观察 大鼠RMCs细胞按照上述分组处理24 h后，于倒置显微镜下观察各个分组的细胞形态。

1.4.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

大鼠RMCs细胞贴壁后，呈梭形、不规则或星形，有数个长短不一的突起，密集生长时，出现重叠现象，细胞团簇之间形成网络（图1a，见封三）与NG组相比，MG组细胞形态基本没有改变，数量有所增加，但不明显（图1b，见封三）；HG组细胞数量明显增加，主要呈梭形，细胞肥大，细胞间重叠现象更明显，细胞边缘不清晰（图1c，见封三）。

与NG组相比，DMSO+NG组0.1%、0.5%细胞形态基本未发生改变，细胞数量有所减少（图2a、b，见封三）；随着DMSO体积分数的不断增大，细胞数量不断减少，细胞形态发生改变，胞质聚拢，突起收缩，由梭形改变为椭圆形，最后呈圆形，由初始的贴壁状态，最终呈漂浮状态（图2c、d、e、f、g、h，见封三）。

与HG组相比，DMSO+HG组0.1%组细胞基本没有变化（图3a，见封三），；随DMSO体积分数的增加，细胞数量和形态发生显著变化，细胞逐渐分散，圆形、漂浮细胞数量不断增加（图3b、c、d、e、f、g、h，见封三）。

2.2 MTT法检测细胞活力

由表1可知，与NG组比较，HG组和MG组均能促进RMCs的增殖，HG组有显著性，差异有统计学意义（P < 0.05），表明高糖对RMCs细胞造成一定损伤，且促进作用是非渗透压造成的。其次，随着DMSO体积分数的不断增加，细胞的OD值不断降低，活细胞数量逐渐减少。与NG组比较，当DMSO终浓度低于0.5%时，DMSO+NG组细胞正常生长且形态完整，细胞活力无显著性变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；当DMSO浓度大于0.5%时，DMSO+NG组细胞形态改变，细胞活力有显著性变化，差异有统计学意义（P < 0.01）。与HG组比较，当DMSO浓度低于0.1%时，DMSO+HG组细胞形态与活力无显著性变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；当DMSO终浓度大于0.1%时，DMSO+HG组细胞形态改变，细胞活力发生极显著性变化，差异有统计学意义（P < 0.01），且随DMSO浓度的增加细胞存活率不断降低。当DMSO浓度在0.5%范围内，DMSO+NG组与含相同体积的DMSO+HG组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。利用Excel 2010中FORECAST函数分别以DMSO+NG组和DMSO+HG组中DMSO浓度为因变量，细胞存活率为自变量，可知IC50正=2.402%，IC50高=2.114%。

随着DMSO浓度的不断增加，大鼠RMCs细胞存活率逐渐降低。在DMSO浓度大于0.1%时，高糖刺激下的大鼠RMCs细胞的存活率低于相同DMSO浓度下正常细胞的存活率。见图4。

3 讨论

DMSO是一种重要的非质子极性溶剂，既能溶于有机溶剂又能溶于水。在细胞领域中，DMSO作为药物的媒介，有助于药物穿透细胞膜，是一种良好的渗透增强剂[7-11]。但DMSO在不同条件下超过临界浓度对细胞有一定损伤，且不同细胞对其敏感性也不同。研究发现，DMSO在4℃环境中对细胞的毒性作用比在室温时小[12]。此外，DMSO终浓度低于2.0%时，对PC12细胞形态和活力无显著影响，大于4.0%时呈现明显的细胞毒性。对人骨髓细胞而言，10%DMSO作为低温保护剂时毒性作用较小，5.0%和20.0%DMSO使骨髓细胞中α-萘酚酯酶（ANAE）、过氧化物酶（POX）活性以及糖原含量显著下降，严重影响细胞功能[13]。本实验研究表明，不同浓度DMSO对相同条件下RMCs细胞影响存在差异，随着DMSO浓度的不断增加，RMCs细胞的活力不断降低；DMSO对不同条件下RMCs细胞存在不同影响，当DMSO终浓度在0.1%时，DMSO使高糖刺激下大鼠RMCs细胞活力显著降低，形态发生改变，但对正常条件下大鼠RMCs细胞的活力及形态无显著性影响。因此，DMSO对细胞影响不能从一种细胞生长环境外推到另一种生长环境，也不能从一种细胞结果推广至另一种细胞。

基于DMSO对不同条件下RMCs细胞及不同种类细胞的影响，体外细胞筛选设计时应充分考虑所用溶剂浓度，最大限度减少或避免对于实验结果的干扰。

实验发现，适当浓度的DMSO对高糖刺激下大鼠RMCs细胞的增殖有一定的抑制作用，为今后2型糖尿病的治疗提供了一种思路[14]，但至于其具体作用机制有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] 杨远，BernsteinI A.二甲亚砜对人表皮的核酸和蛋白质合成的影响[J].中华劳动卫生职业病杂志，1994，12（4）：32-34，60.

[2] Henni-Silhadi W，Deyme M，Boissonnade MM，et al. Enhancement of the solubility and efficacy of poorly water-soluble drugs by hydrophobically-modified polysaccharide derivatives [J]. Pharm Res，2007，24：2317-2326.

[3] 刘开彦，董文川，玉逸兰，等.二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究[J].中国实验血液学杂志，2004，12：670-673.

[4] 韩大良，刘克清，郭少三，等.二甲亚砜、吐温80对小鼠骨髓来源细胞体外生长和活力影响的量效关系分析[J].中国实验血液学杂志，2008，16（2）：377-380.

[5] 吴迪，巴哈尔古丽・卡哈尔，吴桂荣，等.溶媒二甲基亚砜对细胞生长与活力的影响研究[J].新疆医科大学学报，2010，33（5）：489-491.

[6] 贺兵，谢晓燕，张枫，等.不同浓度二甲基亚砜对兔软骨细胞生长的影响[J].中华临床医师杂志：电子版，2014，9（8）：1688-1691.

[7] Foerg C，Merkle HP. On the biomedical promise of cell penetrating peptides：limits versus prospects [J]. J Pharm Sci，2008，97（1）：144-162.

[8] Gump JM，Dowdy SF. TAT transduction：the molecular mechanism and therapeutic prospects [J]. Trends Mol Med， 2007， 13（10）：443-448.

[9] Hanslick JL，Lau K，Noguchi KK，et al. Dimethyl sulfoxide （DMSO） produces widespread apoptosis in the developing central nervous system [J]. Neurobiol Dis，2009，34（1）：1-10.

[10] Qi W，Salvi RJ. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide （DMSO） on cochlear organotypic cultures [J]. Hear Res，2008，236（1-2）：52-60.

[11] Yu HN，Lee YR，Nog EM，et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances DMSO-induced differentiation of HL-60 cells through the activation of ERK/MAPK pathway [J]. Int J Hematol，2008，87（2）：189-194.

[12] 刘作斌，魏汉东，金玉米，等.冷冻保护剂二甲基亚砜的毒副作用及应用剂量研究[J].军医进修学院学报，1990， 11（1）：31-34.

[13] 高玉民，吗韭菜，谢艳，等.冷冻保护剂DMSO对人骨髓细胞部分化学成分的影响[J].中国组织化学与细胞学杂志，1993，2（3）：237-239.

[14] Lin GJ，Sytwu HK，Yu JC，et al. Dimethyl sulfoxide inhibits spontaneous diabetes and autoimmune recurrence in non-obese diabetic mice by inducing differentiation of regulatory T cells [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2015，282（2）：207-214.

（收稿日期：2015-12-16 本文编辑：赵鲁枫）