天麻共生萌发菌栽培种生产工艺条件优化

摘 要：经试验对天麻共生萌发菌MY-001的栽培种生产的工艺条件进行了优化，结果显示，既能降低生产成本又能提高生产效率的液体发酵条件为：液体菌种培养器的气压为0.020MPa，发酵液主要成分中红糖、麦麸和蛋白胨的最佳比例为红糖10g/L、麦麸15g/L、蛋白胨1g/L，萌发菌菌丝生物量随时间的变化符合逻辑斯蒂增长模型，其观测值与逻辑斯蒂方程拟合值的拟合度较高（R2=97.7%），发酵培养144h后生物量趋于稳定，栽培种基质最合适的比例为壳斗科植物树叶60%、阔叶树木屑30%和麦麸10%。

关键词：天麻；萌发菌；液体发酵；工艺优化

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）06-17-03

Optimizing the Gastrodia elata Seed-germinating Strains Production Process

Cheng Lijun1 et al.

（1College of Chemistry and Life Sciences，Zhaotong University，Zhaotong 657000，China）

Abstract：The best production process conditions for Gastrodia elata seed-germinating strain MY-001 were optimized. The results showed that the best liquid fermentation conditions were pressure of 0.020MPa，ermented liquid of brown sugar 10g/L，wheat bran 15g/L，peptone 1g/L. The number increasing ofhypha biomass over time accords with the Logisticgrowth model，the observations fit with the logistic equation fitting thehigher value（R2=97.7%），biomass tends to be stable after fermentation 144h. The optimum cultivation of the substrate were determined fagaceae plant leaves60%，broadleaf sawdust 30%，and wheat bran 10%.

Key words：Gastrodia elata；Germinating strain；Liquid fermentation；Process optimization

天麻（Gastrodia elata Blume）为名贵的传统中药，云南省昭通市是我国公认的天麻道地药材产地，特别是昭通市彝良县小草坝所产的天麻，以优良的品质而驰名中外[1]。天麻属兰科多年生草本植物，无根、无绿色叶片，不能进行光合作用营自养生活，其种子发芽必需依靠小菇属（Mycena）一类萌发菌侵染后才能正常发芽[2-5]。笔者前期对昭通小草坝分离的萌发菌进行了筛选和萌发对比实验，并将筛选出的菌株在昭通实施了推广[3]。随着天麻产业的发展，为加快萌发菌的扩繁，降低生产成本，同时为深入开发利用萌发菌奠定基础，有必要对萌发菌的深层发酵条件进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料 供试萌发菌菌株为MY-001由昭通学院提供；供试药品磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠等均为化学纯。液体发酵设备使用辽宁全禾生物科技有限公司生产的CQY-130型液体菌种培养器。

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝生物量测定方法 将培养基配置（马铃薯200g、葡萄糖15g、红糖10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、泡敌0.3mL、维生素B1 0.005g）后装入培养器中，124℃灭菌30min，冷却至25℃后接种1L液体母种，根据实验要求设计的条件培养完成后，接出1L培养液，摇至菌球在培养液中均匀分布时量取100mL，抽滤、干燥称取菌丝体的重量，每处理设3个重复。

1.2.2 气压对萌发菌MY-001菌丝生长的影响 分别设置液体菌种培养器内的气压为0.020MPa、0.035MPa、和0.050MPa，参照1.2.1的方法，培养120h后，观察菌球的形态，称取菌丝体的重量，每处理设3个重复。

1.2.3 发酵液成分及比例对萌发菌MY-001菌丝生长的影响 根据前期的研究成果，以1L培养基马铃薯100g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、泡敌0.3mL、维生素B 0.005g为基础，分别添加红糖0、10g、20g，麦麸10g、15g、20g、25g及蛋白胨0、1g、2g，参照1.2.1的方法，培养120h后，称量菌丝体的生物量，每处理设3个重复。

1.2.4 萌发菌MY-001菌丝生物量生长曲线 在以上筛选获得的菌丝最佳条件下培养，48h后每隔12h参照1.2.1的方法，称取菌丝体的重量，以培养时间为横坐标，菌丝体生物量为纵坐标绘制生长曲线。数据分析用软件SPSS13.0进行。

1.2.5 栽培种基质比例对萌发菌MY-001菌丝生长速度的影响 萌发菌栽培种培养基质主要由壳斗科植物树叶、阔叶树木屑及麦麸混合组成，为节省生产成本同时方便野外种植时的使用，以壳斗科植物树叶含量60%为基础，参照表1中的比例调整木屑和麦麸。在17cm×33cm的聚丙烯食用菌袋中装入定量的培养基质，灭菌冷却后，每袋接种20mL液体菌种，25℃培养7d后用记号笔在聚丙烯食用菌袋上划出菌丝的生长线，并以此为基线，一个月后记录菌丝生长速度和菌落生长特征，每处理设5个重复。

表1 培养基质中树叶、木屑和麦麸比例（%）

[序号＼&树叶＼&木屑＼&麦麸＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&]

2 结果与分析

2.1 气压对萌发菌MY-001菌丝生长的影响 液体菌种培养器的气压对萌发菌MY-001菌丝生物量的影响见表2。表2显示，气压对菌丝生物量具有显著影响，在低气压状态时菌球生长状况较好，具有明显的毛刺，静止后悬浮于培养液中，当气压在0.020～0.035MPa时菌丝生物量之间不存在显著差异，气压在0.020MPa时达到（0.53±0.03g）。

表2 气压对菌丝生长的影响

[培养器内气压（MPa）＼&菌丝生物量

（g）＼&菌球生长形态＼&0.020＼&0.53±0.03A＼&菌球形态正常，具有明显的毛刺，静止后悬浮于培养液中，少量菌丝分散而不成球状。＼&0.035＼&0.50±0.02AB＼&菌球形态均匀，具有明显的毛刺，但分散菌丝较多。＼&0.050＼&0.49±0.03B＼&菌丝易老化，大量菌丝分散浮于发酵液表层。＼&]

注：菌丝生物量由平均值±标准误差（SE）表示；不同大写字母表示差异显著（P

2.2 发酵液成分及比例对萌发菌MY-001菌丝生物量的影响 发酵液主要成分红糖、麦麸和蛋白胨对萌发菌MY-001菌丝生物量的影响见表3。由表3可知，在液体菌种培养器中随着红糖、麦麸和蛋白胨的增加菌丝生物量也在增加，但为降低生产成本又不影响生长效果，最佳比例为红糖10g/L、麦麸15g/L、蛋白胨1g/L。

表3 发酵液成分及比例对萌发菌MY-001菌丝生物量的影响

[红糖

（g/L）＼&菌丝生物量

（g）＼&麦麸

（g/L）＼&菌丝生物量

（g）＼&蛋白胨

（g/L）＼&菌丝体重量

（g）＼&0＼&0.45±0.03A＼&10＼&0.56±0.03A＼&0＼&0.63±0.01A＼&10＼&0.53±0.04B＼&15＼&0.59±0.02AB＼&1＼&0.72±0.03B＼&20＼&0.55±0.03B＼&20＼&0.63±0.02B＼&2＼&0.74±0.02B＼&＼&＼&25＼&0.65±0.03B＼&＼&＼&]

注：菌丝生物量由平均值±标准误差（SE）表示；不同大写字母表示差异显著（P

2.3 萌发菌MY-001菌丝生物量生长曲线 由图1可知，萌发菌菌丝生物量生长随时间的变化呈“S”型增长，84h以前为增长延迟期，84～144h为对数增长期，144h以后进入稳定期。因此，在萌发菌发酵工艺生产过程中，在发酵培养144h即可获得较高的生物量。采用SPSS13.0进行分析，平均生物量（Y）与发酵时间（X）的关系符合逻辑斯蒂曲线模型（F=426.203，P=0.000

Y=[10.87+126.75×0.951x]，产孢量的实际观测值与数学模拟值能够较好的重合（图1），模型确定系数R2达97.7%，所获得的参数能通过t检验（t=3.418，P=0.007

图1 菌丝生物量观测值与逻辑斯蒂方程拟合值的比较

2.4 栽培种基质比例对萌发菌MY-001菌丝生长速度的影响 栽培种基质的不同比例对萌发菌MY-001菌丝生长速度的影响见表4。表4显示，基质主要成分壳斗科植物树叶、阔叶树木屑和麦麸各占60%、25%和15%时菌丝生长速度最快，达（0.52±0.02）cm/d，但考虑到降低生产成本又不显著影响菌丝生长效果，当壳斗科植物树叶、阔叶树木屑和麦麸各占60%、30%和10%时，菌丝日均生长速度为（0.48±0.05）cm/d，与1#相比不存在显著差异，但成本较低。

表4 栽培种基质比例对萌发菌MY-001菌丝生长速度的影响

[序号＼& 基质成分比例（%） ＼&菌丝日均生长速度

（cm/d）＼&差异显著性＼&树叶＼&木屑＼&麦麸＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&0.51±0.04＼&A＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&0.52±0.02＼&A＼&]

（下转176页）

（上接18页）

[序号＼& 基质成分比例（%） ＼&菌丝日均生长速度

（cm/d）＼&差异显著性＼&树叶＼&木屑＼&麦麸＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&0.48±0.05＼&AB＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&0.43±0.03＼&B＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&0.33±0.05＼&B＼&]

注：菌丝生物量由平均值±标准误差（SE）表示；不同大写字母表示差异显著（P

3 讨论与结论

目前在各天麻产区菌种的需求量日益扩大，随着生物发酵工程技术的发展，由于液体发酵具有生产成本低、时间短、生产快、污染少等特点，将取代传统、朴素的固体制种技术成为趋势[6]。本研究通过对天麻共生萌发菌MY-001的深层发酵条件工艺的优化，筛选合适的发酵条件对产业的发展具有重要意义。研究结果显示，既能降低生产成本又能提高生产效率的液体发酵条件为：液体菌种培养器的气压为0.020MPa；发酵液主要成分红糖、麦麸和蛋白胨最佳比例为红糖10g/L、麦麸15g/L、蛋白胨1g/L；萌发菌菌丝生物量随时间的变化符合逻辑斯蒂增长模型，其观测值与逻辑斯蒂方程拟合值的拟合度较高（R2=97.7%），发酵培养144h后生物量趋于稳定；栽培种基质中使用壳斗科植物树叶的天麻种子萌发效果较好，能促进种子的萌发[2]，因此选用壳斗科植物的树叶作为主要成分，经筛选最合适的比例为壳斗科植物树叶60%、阔叶树木屑30%和麦麸10%。

参考文献

[1]李德勋，张观敏，马跃新.昭通天麻的原植物调查与鉴定[J].现代中药研究与实践，2005，19（1）：29-31.

[2]徐锦堂.中国天麻栽培学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：1-99.

[3]杨世林，兰进，徐锦堂.天麻的研究进展[J].中草药，2000，3（1）：66-69.

[4]徐锦堂，郭顺星，范黎，等.天麻种子与小菇属真菌共生萌发的研究[J].菌物系统，2001，20（1）：137-141.

[5]郭顺星，王秋颖.促进天麻种子萌发的石斛小菇优良菌株特性及作用[J].菌物系统，2001，20（3）：408-412.

[6]林静，赵萍，何莉莉，等.食用菌液体菌种培养器的设计[J].农机化研究，2007（9）：105-108. （责编：张宏民）