小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法研究

作者：胡燕，冯敬文，卢其福，龙晓英

【摘要】 目的建立同时测定小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷含量的高效液相色谱法。方法 采用diamonsiltm c18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱，乙腈-0.02%(体积分数)磷酸溶液(体积比23∶77)为流动相，流速为1 ml·min-1，检测波长为228 nm，柱温为30 ℃。结果 连翘苷在0.13~160.20 μg范围内与峰面积呈良好线性关系 (r=0.999 8)，平均回收率为99.43%，rsd=1.02%(n=6)。牛蒡子苷在0.13~322.40 μg范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 7)，平均回收率为99.66%，rsd=1?54%(n=6)。结论 该法专属性强、重现性好，可作为小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法。

【关键词】 高效液相色谱法;小儿清热利肺口服液;连翘苷;牛蒡子苷

abstract:objectiveto establish a rp-hplc method for the determination of forsythin and arctiin in xiaoer qingre lifei oral solution.methods the analysis was performed on diamonsiltm c18 column with the mobile phase of acetonirile-0.02% phosphoric acid solution (23∶77) under a flow rate of 1 ml·min-1.the detection wavelength was set at 228 nm and column temperature was 30 ℃.results the calibration curve of forsythin was linear in the range of 0.13-160.20 μg (r=0.999 8).the average recovery of forsythin was 99.43% with rsd=1.02% (n=6).the calibration curve of arctiin was linear in the range of 0.13-322.40 μg (r=0.999 7).the average recovery of arctiin was 99.66% with rsd=1.54% (n=6).conclusion the method is exclusive and reproducible.it can be applied to determine forsythin and arctiin in xiaoer qingre lifei oral solution.

key words:hplc; xiaoer qingre lifei oral solution; forsythin; arctiin

小儿清热利肺口服液由银翘散和麻杏石甘汤两个古方化裁而成,由银花、连翘、牛蒡子、麻黄等11味中药组成[1],主治外感风热邪在肺卫或卫气同病之风热咳嗽,用于发热、咳嗽或咯痰、流涕或鼻塞、咽痛、口渴、舌红或苔黄等证候的小儿急性支气管炎,临床疗效甚佳。连翘、牛蒡子分别为本方的君、佐药,而连翘苷、牛蒡苷分别为两者的特征有效成分。小儿清热利肺口服液的原质量标准采用紫外-可见分光光度法测定其盐酸麻黄碱含量，并未对连翘苷、牛蒡苷进行含量检测。本试验采用hplc法同时测定小儿清热利肺口服液中连翘苷、牛蒡苷的含量，旨在增加小儿清热利肺口服液的质量控制指标，提高其质量可控性。

1仪器与试剂

lc-20a高效液相色谱仪(日本岛津)，spd紫外检测器，二元高压梯度泵;bp211d电子分析天平(satorius);uv-2450可见-紫外分光光度仪(日本岛津); hh-6恒温水浴锅(宏华新佳);连翘苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：11084-200711);牛蒡子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110819-200404);小儿清热利肺口服液(广州潘高寿药业股份有限公司提供，批号：e06002、f03002b、f10001b、i11002b);乙腈、h3po4为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：diamonsiltm c18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相：乙腈-0.02%(体积分数)磷酸溶液(体积比23∶77);流速：1 ml·min-1;检测波长：228 nm;柱温：30 ℃;进样量：20 μl。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1对照品贮备液的制备精密称取连翘苷对照品(于室温用p2o5干燥24 h)8.01 mg，置25 ml量瓶中，加50%(体积分数)甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得连翘苷对照品贮备液;精密称取牛蒡子苷对照品(于室温用p2o5干燥24 h)8.06 mg，置25 ml量瓶中，加50%(体积分数)甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得牛蒡子苷对照品贮备液。

2.2.2对照品溶液的制备分别精密吸取连翘苷、牛蒡子苷对照品贮备液适量，同置于25 ml量瓶中，用50%(体积分数)甲醇稀释成连翘苷质量浓度为0.096 mg·ml-1、牛蒡子苷质量浓度为0.097 mg·ml-1的对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

精密吸取小儿清热利肺口服液1 ml至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，每次10 ml，合并三氯甲烷萃取液于90 ℃水浴上蒸干，残渣用50%(体积分数)甲醇溶解并转移至50 ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4阴性对照溶液的制备

取处方组成中除连翘、牛蒡子之外各药材,按照小儿清热利肺口服液制备工艺制备药液，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5系统适用性试验

分别精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各20 μl注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,记录色谱图。在此条件下,连翘苷、牛蒡子苷和其他组分可达到基线分离,分离度r>5。理论塔板数以连翘苷计，应不低于3 000;以牛蒡子苷计应不低于1 500。阴性对照对连翘苷、牛蒡子苷的测定无干扰，见图1。[psd281;s*2〗a.连翘苷和牛蒡子苷对照品; b.供试品; c.阴性对照;1.连翘苷; 2.牛蒡子苷图1小儿清热利肺口服液的hplc图figure 1hplc chromatograms of xiaoer qingre lifei oral solution

2.6线性关系考察

精密吸取连翘苷、牛蒡子苷对照品贮备液适量,同置于25 ml量瓶中，用50%(体积分数)甲醇稀释成每1 ml含连翘苷分别为0.13、32.04、64.08、96?12、160.20 μg，含牛蒡子苷分别为0.13、64.48、128.96、161.20、322.40 μg的系列对照品溶液。分别吸取上述不同浓度的对照品溶液各20 μl,按“2?1”项下色谱条件进样,测定峰面积。以峰面积积分值(a)对对照品质量浓度(ρ)绘制标准曲线，求得连翘苷回归方程为a=4.2277×104ρ+1.8754×104，r=0.999 8,线性范围为0.13~160.20 μg·ml-1;牛蒡子苷回归方程为a=3.7802×104ρ-1?1179×105，r=0.999 7，线性范围为0.13~322?40 μg·ml-1。

2.7精密度试验

精密吸取同一对照品溶液(连翘苷质量浓度为0.096 mg·ml-1、牛蒡子苷质量浓度为0.097 mg·ml-1)20 μl注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积。结果连翘苷、牛蒡子苷rsd值分别为1?41%、1?25%，表明仪器精密度较好。

2.8稳定性试验

精密吸取同一供试品(批号f03002b)溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、18、24 h进样。结果连翘苷、牛蒡子苷rsd值分别为2.19%、2.20%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9重复性试验

取同一批号(批号i11002b)小儿清热利肺口服液，按“2.3”项下方法平行制备5份供试品溶液，分别依法进样。结果连翘苷、牛蒡子苷rsd值分别为0.59%、1.50%，表明本法重复性良好。

2.10加样回收率试验

分别精密吸取同一批小儿清热利肺口服液(批号e06002)经适当稀释后的药液共6份(连翘苷、牛蒡子苷质量分数浓度分别为0.058 6 、1.102 7 mg·ml-1)，每份1 ml，分别精密加入经适当稀释的连翘苷、牛蒡子苷对照品贮备液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件测定并计算。结果见表1。

表1加样回收率试验结果

2.11样品测定

取3批(批号e06002、f03002b、f10001b)小儿清热利肺口服液适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取对照品溶液和各供试品溶液20 μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下条件进行测定，以外标法计算样品中连翘苷、牛蒡子苷的含量。结果3个批号样品中连翘苷质量浓度分别为0.223 7、0.149 1、0.238 6 mg·ml-1，rsd值分别为0?7%、1.1%、0.3%;牛蒡子苷质量浓度分别为4?571 3、1?93 0、1.735 0 mg·ml-1，rsd值分别为0?8%、0?9%、1.1%。

3讨论

3.1波长的选择

通过对连翘苷、牛蒡子苷对照品溶液在200~400 nm范围内进行紫外光谱扫描检测显示，连翘苷在208、228、277 nm处有最大吸收，牛蒡子苷在228、278 nm处有最大吸收。当波长为228 nm时，图谱响应灵敏，峰形尖锐对称，能同时测定连翘苷、牛蒡子苷的含量，且两峰灵敏度均高于在277、278 nm测定时的灵敏度。故选用228 nm作为检测波长。

3.2流动相的选择

本研究曾以不同比例的甲醇-水[2]48-49、乙腈-水[2]117-118、乙腈-不同体积分数磷酸溶液等系统为流动相进行了比较研究。结果表明,采用乙腈-水(体积比23∶77)系统时，牛蒡子苷、连翘苷与其他杂质峰能达到基线分离，出峰时间适当，阴性样品无干扰，但牛蒡子苷拖尾较严重。加入0.02%(体积分数)磷酸后则拖尾现象明显缓解，峰形较对称，因此选择乙腈-0.02%(体积分数)磷酸水溶液(体积比23∶77)作为流动相。

3.3提取方法的选择

3.3.1提取方式的确定在供试品制备方法的选择中,曾尝试将样品液的甲醇超声提取液直接进样检测,但要使牛蒡子苷、连翘苷与其他杂质峰达到基线分离需耗时100 min，且目标峰后有较多杂质峰，为不影响下一个样品的测定，必须等待约60 min，耗时过长，不符合实验要求。因此展开对样品纯化方式的研究。结果表明，将甲醇超声提取液通过中性氧化铝[3]或大孔吸附树脂[4]处理对牛蒡子苷能起到一定程度的纯化作用,但经中性氧化铝柱纯化后牛蒡子苷含量测定值明显偏低,且纯化效果不理想。而溶剂萃取法能较好去除杂质，连翘苷与牛蒡子苷的含量损失较少，且方法简便、快速，因此确定使用溶剂萃取的方式处理样品。

3.3.2萃取溶剂的选择本品为复方制剂,成分复杂,因此考虑先用乙醚萃取除去样品中脂溶性成分再用水饱和正丁醇萃取纯化[5],或直接用三氯甲烷进行萃取[6]。通过对2种方法萃取效果的对比发现，采用三氯甲烷直接萃取除杂质效果良好，连翘苷、牛蒡子苷含量也相对较高，且测定时能在较短时间内达到基线分离，故选择三氯甲烷为萃取溶剂。

3.3.3萃取溶剂用量与萃取次数的考察对三氯甲烷的用量(5、10、20、30倍)与萃取次数(3、4次)进行了比较。结果表明，10倍三氯甲烷萃取3次所得萃取液中2种苷类成分的含量较20倍、30倍三氯甲烷萃取3次的含量低;20倍、30倍三氯甲烷萃取3次所得2种苷类成分的含量基本一致;10倍萃取4次所得目标成分含量与20倍、30倍三氯甲烷萃取3次的含量基本一致，且比5倍三氯甲烷萃取4次的含量要高。结合萃取时“少量多次”的原则，确定萃取溶剂用量为10倍，萃取次数为4次。

牛蒡子与连翘为复方中常用的配伍药味。本实验所确定的色谱条件是在成分复杂的大复方上摸索而得，可同时测定牛蒡子苷与连翘苷的含量，操作简便、结果准确、专属性及重现性好,为其他同时含有牛蒡子与连翘的复方中药制剂的质量控制提供了重要的参考依据。

【参考文献】

[1] 易明娟,谢子清,谭亿明,等.清热利肺口服液的药理研究[j].成都中医药大学学报，1997,20(4):35-39.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[m].北京:中国医药科技出版社,2010.

[3] 万莉,平,潘小华.hplc测定复方银桔糖浆中连翘苷的含量[j].中成药，2008,30(1):151-152.

[4] 张玉,黄海欣.hplc测定双黄连口服液中连翘苷的含量[j].华西药学杂志,2005,20(4):360.

[5] 李芳美,林朝展,甄松峰,等.rp-hplc法测定抗病毒口服液中芒果苷和连翘苷的含量[j].中药新药与临床药理,2009,20(1):47-49.

[6] 傅军,李焕丹,高晓霞.hplc法测定保和口服液中连翘苷的含量[j].中药新药与临床药理,2005,16(6):442.