丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin—a原核表达载体的构建

[摘要] 目的 探讨丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建方法。 方法 从Pubmed中查到Luffin-a的mRNA全序列，用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜种子中克隆Luffin-a基因，T-A克隆后鉴定核苷酸序列，构建原核表达载体pET-15b（+）-Luffin-a，转化大肠杆菌BL21（DE3），并经IPTG诱导表达；SDS-PAGE鉴定Luffin-a表达产物。结果 克隆出Luffin-a基因，IPTG诱导后大肠杆菌培养液和超声破碎的菌体沉淀中都有Luffin-a表达产物。 结论 本研究成功构建了Luffin-a原核表达载体。

[关键词] 丝瓜籽；核糖体失活蛋白；Luffin-a基因

[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（a）-0022-03

核糖体失活蛋白（RIP）是一种能够使真核细胞核糖体28s rRNA第4 324位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而使真核细胞蛋白质合成受到不可逆抑制的蛋白，广泛存在于丝瓜种子中。目前分离到的Luffin-a[1-3]、Luffin-b[4]以及新型小分子蛋白Luffin-s[5]、Luffin-P1[6，7]均属于Ⅰ型RIP。进年来的研究发现，RIPs能抑制HIV病毒在急慢性感染的淋巴细胞和单核巨噬细胞中的复制，具有抗病毒、抗肿瘤、诱导细胞凋亡等生物活性[5，8]。本实验成功构建Luffin-a的原核表达载体，对Luffin-a的体外表达做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌TOP10 感受态细胞和BL21（DE3）pLys表达菌株及克隆载体pGM-T均购自TIANGEN公司，原核表达载体pET-15b（+）由湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所赠送。Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自Promega公司，2×Taq PCR MasterMix、质粒小提试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、DNA Marker D2000、D15000、DNA Marker Ⅳ、IPTG均购自TIANGEN公司，限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 提取总RNA及cDNA第一链合成 用Trizol常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，用50 μL DEPC H2O溶解RNA样品，紫外分光光度仪检测RNA样品浓度与纯度，-80℃保存备用。以2 μg总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明操作，反应体系：oligdT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1.25 μL，加入RNA适量体积后用DEPC H2O补足体积至18.5 μL，70℃反应5 min，立即插冰上；再加入逆转录酶mmlv（200 U/μL）1 μL，抑制剂rRNasin（40 U/μL）0.5 μL，5×buffer 5 μL，使总反应体系为25 μL，42℃反应1 h，95℃反应3 min终止反应，cDNA产物-20℃保存。

1.2.2 引物设计及Luffin-a基因PCR扩增 根据Pubmed中检索得到的Luffin-a核酸序列，由上海生工设计合成一对引物，在正向引物5'端引入NdeⅠ酶切位点，在互补链引物5'端引入BamHⅠ酶切位点（斜体），上下游引物之间扩增产物长760 bp。上游引物：5'-gcccatatggatgtgaggttcagtttgtc-3'；下游引物：5'-ggcggatcctcacgcaacatt ttgtttgta-3'。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6.5 μL，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min；PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物纯化及Luffin-a表达载体的构建 根据DNA纯化回收试剂盒说明操作将PCR产物进行纯化，按照pGM-T克隆试剂盒说明将Luffin-a基因PCR产物与pGM-T载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌扩增，用质粒小提试剂盒提取重组质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒命名为pGM-T-Luffin-a，采用菌落PCR和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将重组质粒pGM-T-Luffin-a和原核表达载体pET-15b（+）分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，20 μL反应体系（NdeⅠ 1 μL、BamHⅠ 1 μL、10×buffer TangoTM 2 μL、质粒DNA 1 μg、nuclease-free water补足20 μL体积），37℃反应过夜，琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA条带，T4DNA连接酶定向连接Luffin-a和pET-15b（+），16℃反应过夜，重组质粒命名为pET-15b（+）-Luffin-a；将连接产物转化BL21（DE3）pLys感受态细胞，涂LB（ampr）平板，挑取单克隆菌划线培养，进行菌落PCR鉴定；将正确的重组子进一步接种于含50 μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，少量提取质粒，进行酶切鉴定和测序验证。

1.2.4 Luffin-a的表达及表达产物的检测 将含有正确表达载体pET-15b（+）-Luffin-a的转化菌BL21（DE3）pLys接种于20 mL含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，按1∶100接种至200 mL含相应抗生素的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.7，留部分菌液做为诱导前对照，剩余部分加IPTG至浓度为1.0 mmol/L诱导表达6 h。分别取30 mL菌液4℃ 2 000 r/min离心15 min收集菌体，用PBS洗涤沉淀2次，加入1 mL裂解液悬浮沉淀，反复超声冻融至菌液变清亮，12 000 r/min离心取上清，100℃煮沸5 min，进行PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 丝瓜Luffin-a基因片段的PCR扩增

Trizol常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，紫外分光光度仪检测RNA样品A260/A280值为1.83，说明样品纯度好。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中拍照取图，在760 bp处有一条强荧光条带，其大小与预期片段大小一致。

2.2 Luffin-a基因重组表达质粒的鉴定

PCR产物切胶回收，与T载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，提取重组的克隆载体，采用菌落PCR和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物和原核表达载体PET-15b（+）分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，T4DNA连接酶定向连接，16℃反应过夜；重组质粒pET-15b（+）-Luffin-a转化BL21（DE3）pLys感受态细胞，涂LB（ampr）平板，挑取单克隆菌划线培养，进行菌落PCR鉴定。将正确的重组子接种于含氨苄霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，少量提取质粒，进行酶切，用1%琼脂糖电泳检测。酶切结果显示，在750 bp和5 500 bp附近各有一条带，说明Luffin-a已经插入表达载体pET-15b（+）。

1.pGM-T-luffin-a PCR鉴定产物；2.pET-15b（+）-Luffin-a PCR鉴定产物；3.DNA Marker（D2000）

2.3 Luffin-a的诱导表达

将重组表达质粒pET-15b（+）-Luffin-a转化表达感受态BL21（DE3）pLys菌株，在含相应抗生素的LB液体培养基中振荡培养，经IPTG诱导6 h，在菌液以及超声上清和沉淀中均可见约27 kD的蛋白被诱导表达，与预期结果相符。不含重组表达质粒的空载体工程菌经诱导后没有出现这一条带（图4）。从而说明重组表达质粒pET-15b（+）-Luffin-a在这一宿主菌中可表达丝瓜核糖体失活蛋白RIP。

3 讨论

RIPs是一类毒蛋白，其主要酶学性质是具有RNA N-糖苷酶活力，更确切地说是多聚核苷酸∶腺苷糖苷酶活力，可特异地修饰核糖体大亚基rRNA 3'-端茎环结构的腺嘌呤残基而导致核糖体失活，阻止多肽链的延伸，从而抑制靶细胞中蛋白质合成。RIPs不影响自身 28s rRNA，但对亲缘关系较远生物的核糖体表现不同程度的损伤。核糖体失活蛋白主要存在于植物当中，特别是苦瓜、丝瓜等葫芦科植物的果实和种子中有多种核糖体失活蛋白。根据RIPs的物理特性可将其分为3类：1型、2型和3型，目前分离到的Luffin-a[1]、Luffin-b[4]及新型小分子蛋白Luffin-s[8]、Luffin-P1[7，9]均属Ⅰ型RIP。作为非病原性的一类毒蛋白基因，用做抗病毒的转基因材料，Luffin具有一定的应用前景。对丝瓜核糖体失活蛋白的研究报道较少，最先发现丝瓜种子中毒蛋白的是Kishida等[10]，他们将其命名为Luffin。1988年研究者从丝瓜籽中分离到两种单链核糖体失活蛋白Luffin-a和 Luffin-b。在1990年和1992年相继报道Luffin-a的氨基酸序列和cDNA序列。研究发现，丝瓜种类不同，从其种子中提取的核糖体失活蛋白的氨基酸序列也有不同，其毒性也不同[1]。目前对丝瓜核糖体失活蛋白的体外研究很少，Au等[11]发现luffin能有效抑制HIV-1整合酶的活性。有研究发现，RIPs能抑制人类肿瘤细胞，同时又不杀死或很少杀死正常细胞[4-5]。

总之，丝瓜RIP有广泛的应用前景，但仍有许多问题有待解决，如各种luffin的同源性，小分子量luffin是完全的新物质，或是某些大分子luffin的剪切产物，还是某一基因不同时期的表达产物；几种luffin的活性位点是否相同等。本研究根据报道的Luffin-a[2]核酸序列，构建其原核表达载体，体外诱导表达丝瓜核糖体失活蛋白，为进一步研究luffin的酶学性质及其抗病毒、抑制肿瘤、诱导细胞凋亡等方面的生物学活性奠定基础。

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（收稿日期：2012-12-17 本文编辑：程 铭）