肉质相关基因TCAP启动子与转录因子MyoD结合的ChIP分析

摘要：为了检测肉质相关基因TCAP（Titin-cap，Telethonin）启动子与转录因子MyoD（Myogenic differentiation antigen）的体内结合情况，采用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）结合PCR技术分析TCAP启动子与转录因子MyoD的结合。结果表明，以MyoD抗体免疫沉淀的DN段为模板，PCR扩增获得了TCAP基因启动区121 bp的片段，实现了转录因子MyoD与TCAP启动子DNA序列结合。试验证实TCAP基因是MyoD调控的下游基因，在肌肉发育过程中发挥重要作用。

关键词：染色质免疫共沉淀；TCAP基因；MyoD转录因子

中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5612-03

动物的产肉潜力及肌肉品质与肌纤维的数量和生长密切相关。TCAP（Titin-cap，Telethonin）蛋白作为一种肌丝蛋白在肌原纤维的组装过程中发挥着重要作用，其在横纹肌和心肌异性表达，是肌联蛋白激酶的作用底物，并绑定于肌联蛋白Z1-Z2区，通过连接和支撑肌联蛋白为其他肌纤维蛋白提供空间上固定的结合位点[1]。TCAP基因与肌肉萎缩[2]、心肌症[3，4]、肌营养不良[5]等均相关。在培养的骨骼肌细胞中，通过RNA干扰发现TCAP基因下调表达后会抑制成肌细胞的分化[6]，这些都证实了TCAP基因与骨骼肌发育关系密切。

TCAP基因由2个外显子组成，在人、鼠和猪中编码167个氨基酸，在牛中编码166个氨基酸[7]，且在不同物种间高度保守[8]。研究表明牛TCAP基因内含子1和外显子2的SNP位点与肉质性状显著相关[9]。黄京书[10]克隆了猪TCAP基因并发现了4个SNP位点，且G334A位点基因型与猪屠宰率、瘦肉率、6～7腰椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部平均背膘厚、三点平均背膘厚、眼肌高、眼肌宽、至第一颈椎胴体长、至第一胸肋胴体长极显著相关，且肥肉率、肩部背膘厚、瘦肥比率性状在不同基因型间的差异也达到显著水平。

TCAP基因对猪肉质性状有着密切影响，但是其作用的具体机制还不明确。课题组在前期工作中克隆了猪TCAP基因启动子1 662 bp序列，构建了7个启动子缺失片段重组质粒分别转染C2C12细胞。结果表明，各个片段的启动子活性都显著提高，其中-155 bp/+33区段启动子活性最高，推测为潜在的核心启动子区。利用生物信息学技术对猪TCAP基因启动子区序列做进一步分析后发现存在调控肌肉生长发育的肌分化因子（Myogenic differentiation antigen，MyoD）转录因子结合位点，且将构建的转录因子MyoD超表达载体与TCAP基因启动子序列进行共转染，发现启动子活性明显升高，说明MyoD对TCAP基因的表达具有一定的调控作用。故试验采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）体内验证TCAP基因启动子序列与转录因子MyoD的结合情况，进一步探讨TCAP基因影响肉质性状的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

C2C12细胞系来源于华中农业大学，用含10%胎牛血清的DMEM培养基对C2C12细胞进行培养。

1.2 试剂

染色质免疫沉淀试剂盒EZ-ChIPTM Chromatin Immunoprecipitation Kit，购自美国Millipore公司；MyoD兔抗鼠的单克隆抗体，购自英国Biorbyt公司；VC750型超声波破碎仪，购自美国Sonics公司；BIO-RAD Mylyder PCR仪，购自美国BIO-RAD公司；Taq酶、dNTPs等PCR试剂，购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞交联固定 细胞培养于培养皿中，待细胞汇合度达80%～90%，添加含有1%甲醛的20 mL细胞培养基，室温孵育10 min后加甘氨酸终止交联。置于冰上，用含蛋白酶抑制剂的预冷的PBS冲洗细胞，然后刮取细胞收集到离心管中，于4 ℃、800 r/min离心3 min，加入含蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬细胞，再按照每管400 μL分装溶解物（约含4×106个细胞），保存备用。

1.3.2 超声波破碎细胞及条件优化 调整超声波破碎仪功率大小、破碎时间、停顿时间、重复次数等条件，在冰上破碎细胞，使染色质DNA成为200～1 000 bp的片段，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃不容物，将DNA纯化后用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果。

1.3.3 染色质免疫沉淀 每100 μL溶解物中含1×106个细胞，加入900 μL含蛋白酶抑制剂的ChIP稀释缓冲液、60 μL蛋白G-琼脂糖，4 ℃旋转孵育60 min，5 000 r/min离心1 min获得琼脂糖颗粒（去除非特异结合的分子），将上清转移至新的离心管中，并取出10 μL（1%）作为“Input”对照。在剩余上清液中，加入相应的抗体到上清液中，阳性对照中加入1 μg RNA PolymeraseⅡ抗体；阴性对照加入1 μg鼠IgG抗体；检测样本中加入2 μg MyoD抗体，4 ℃旋转孵育过夜。然后加入60 μL蛋白G-琼脂糖，4 ℃旋转孵育60 min（以收集抗体/转录因子复合体），5 000 r/min离心1min，小心移除上清液（内含未结合及非特异DNA）。最后依次用低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCL洗涤缓冲液、TE缓冲液洗涤蛋白G/抗体/转录因子/DNA复合物。

1.3.4 解交联及DNA纯化 向复合物中加入200 μL洗脱缓冲液，轻弹管壁混匀，室温放置15 min，5 000 r/min离心1 min，收集上清液，加入5 mol/L NaCl，并于65 ℃水浴5 h，以解交联获得游离DNA。加入RNase A 37 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mol/L EDTA、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.5）、蛋白酶K于45 ℃孵育60 min。采用试剂盒配套离心柱纯化获得DNA。

1.3.5 PCR鉴定 根据猪和小鼠TCAP基因序列，选择包含预测转录因子结合位点及序列保守区域设计引物。上游引物5′-GTGAGTCTTGGCTCTGCT

TA-3′，下游引物5′-TCTGCTATGTCCTGCTCCT-3′，采用20 μL反应体系。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物（121 bp）以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 超声波条件优化

为了获得最佳超声波破碎条件，获得200～1 000 bp的有效DN段（500 bp左右最佳），试验采用了8个不同条件来处理样本（4×106个细胞），比较染色质剪切效果（图1），发现采用30%功率，破碎15 s，停顿50 s，重复15次可获得500 bp左右片段，且降解较少。破碎时间太短，染色质无法间断；而功率过高、破碎时间太长会造成较多DN段降解。

2.2 染色质免疫共沉淀检测结果

分析猪和小鼠TCAP基因启动子区序列，选择保守区域且包含预测的MyoD转录因子结合位点的序列设计PCR引物，以免疫沉淀的DN段为模板，目的片段为121 bp。阳性对照以RNA PolymeraseⅡ抗体免疫沉淀的DNA为模板，阴性对照以鼠IgG抗体免疫沉淀的DNA为模板，Input对照以没有进行免疫沉淀反应的DNA为模板，空白对照无DNA模板。结果（图2）表明，阳性对照和Input对照均有目的扩增条带，而阴性对照和空白对照未检测到目的扩增条件，说明试验结果正确可信。采用MyoD抗体免疫沉淀的DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的扩增条带，且对扩增产物测序鉴定序列正确无误，证实在C2C12细胞中MyoD转录因子可与TCAP基因启动区DNA序列结合。

3 小结与讨论

研究报道表明TCAP基因在骨骼肌发育中发挥重要作用，且与猪和牛等动物的肉质性状显著相关，但是其作用机制还不清楚。在课题组前期研究工作中，发现TCAP基因启动子区存在MyoD转录因子结合位点，且将构建的转录因子MyoD超表达载体与TCAP基因启动子序列进行共转染C2C12细胞，发现启动子活性明显升高。而试验采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP），在C2C12细胞中证实TCAP基因启动子序列与转录因子MyoD的结合，说明MyoD参与TCAP基因的表达调控。

MyoD是成肌调节因子（MRF）家族成员之一，不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化，而且能把成纤维细胞、脂肪细胞等转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维。在形成肌肉特异基因转录调控中起着总开关的作用[11]。MyoD缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行[12]，如应用基因敲除试验表明缺乏MyoD和Myf5的小鼠没有肌肉形成，没有肌肉标志出现，也没有myogenin促进的转录过程。仅有Myf5而没有MyoD基因的小鼠，仅表达半量的Myf5和myogenin RNA。敲除myogenin基因，在胚胎鼠正常数目的肌细胞发生部位可产生几乎正常数目的成肌细胞，但不能向肌细胞分化。田璐等[13]研究了3个黄牛品种及4个杂交肉牛群体MyoD基因的多态性，并发现其显著影响肉牛多个肉质性状，如宰前活重、胴体重、净肉重、高档肉重、眼肌面积等。邱海芳等[14]采用PCR-RFLP方法对通城猪、大白猪和长白猪3个纯种及长大通猪和大长通猪2个三元杂种共5个群体MyoD基因第1内含子的多态性进行了研究，发现该基因变异会显著影响猪肉的肉色评分是失水率；还发现猪MyoD区域与人和小鼠是保守的，而且这个区域存在影响生长和肉质性状的QTL，揭示MyoD基因在肌肉发育过程中发挥了重要作用。

综上所述，本研究发现转录因子MyoD与TCAP基因启动子区DNA序列结合，TCAP基因可能是MyoD调控的一个下游基因，肌分化因子决定因子MyoD激活后，能进一步激活TCAP基因的表达，为肌纤维蛋白提供空间上的结合位点，有利于肌原纤维的组装，促进成熟的肌纤维形成。这也从侧面证实了TCAP基因在肌肉发育过程中发挥重要作用，然而其是否受其他肌肉发育相关转录因子调控，及具体作用机制还有待进一步研究。

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