改性葡聚糖纳米凝胶止血性能的研究

[摘要] 目的 研究改性葡聚糖纳米凝胶的止血效果。 方法 通过试管法比较纳米凝胶与市售止血剂血盾的体外凝血效果；建立新西兰兔耳缘静脉、耳动脉、肝脏及股动脉出血模型，分别用医用纱布、血盾和纳米凝胶止血，根据止血时间和出血量评价止血效果。 结果 纳米凝胶体外凝血优于血盾，且凝血过程不产热。耳缘静脉及耳动脉出血模型中，纳米凝胶的止血时间和出血量明显低于医用纱布，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；纳米凝胶略低于血盾，差异无统计学意义（P > 0.05）；肝脏出血模型中，纳米凝胶的止血时间明显低于医用纱布和血盾，差异有统计学意义（P < 0.05）；股动脉出血模型中，纳米凝胶止血时间比血盾短。 结论 改性葡聚差异有统计学意义糖纳米凝胶止血效果优异，是一种良好的止血材料。

[关键词] 纳米凝胶；吸水性；止血时间；失血量

[中图分类号] TS251.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the hemostatic effect of modified dextran nanogel. Methods The in vitro blood clotting ability of nanogel and commercial hemostatic agent Flashclot was evaluated by inverting tubes. Hemorrhage models of ear vein， ear artery， liver and femoral artery in New Zealand rabbits were established. Then hemostatic effect was evaluated by observing total blood loss and hemostatic time stopped bleeding with standard gauze， Flashclot and nanogel. Results Nanogel showed better clotting ability than commercial hemostatic agent Flashclot in vitro， and nanogel did not cause exothermic burn when absorbing liquid， which was superior to Flashclot. Compared with standard gauze， the blood loss and hemostasis time were dramatically reduced by nanogel in hemorrhage models of ear vein and ear artery （P < 0.05 or P < 0.01）； Flashclot and nanogel had no statistically significant （P > 0.05）. Compared with standard gauze and Flashclot， hemostasis time were dramatically reduced by nanogel in hemorrhage models of liver （P < 0.05）. Hemostasis time of nanogel was shorter than Flashclot in hemorrhage models of femoral artery. Conclusion The hemostatic effect of the modified dextran nanogel was excellent and it can be a potential hemostatic agent.

[Key words] Nanogel； Swelling behavior； Hemostatic time； blood loss

止血是o急医疗救治中的一个重要的环节，交通事故、手术以及战争中出现的突发性创伤均会引发大量出血，因此快速有效的止血对于提高患者生存率尤为重要[1]。在伤口处按压纱布是传统的止血方法，虽然被广泛使用，但它对严重出血无效，而且可能会造成周围组织的坏死[2-3]。近十年来，出现了很多市售的局部外用止血剂。如纤维蛋白敷料、壳聚糖敷料、沸石类止血剂QuickClot等[4-5]。纤维蛋白敷料昂贵的价格和脆性限制了它的应用[6]；壳聚糖敷料不能用于对壳聚糖敏感的患者，且它的止血效果不稳定[7]；QuickClot是通过在出血处凝集血液达到止血效果，但它的凝血过程是放热反应，会引起热灼伤，因此需要在使用后移除[8-9]。因此需要一种止血材料满足快速高效止血的要求。

前期的研究中已经通过乳液聚合法，将改性葡聚糖和丙烯酸共聚[10-11]，制备成粒径分布均匀的改性葡聚糖纳米凝胶，其具有优异的吸水性能，在PBS中的溶胀率为37 g/g。为了进一步评价该改性葡聚糖纳米凝胶的止血性能，本实验通过体外凝血实验和新西兰兔耳缘静脉、耳动脉、肝脏及股动脉出血模型，评价该纳米凝胶的止血性能，以期为临床新型止血剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 无菌医用纱布购于上海宏隆医疗用品设备有限公司；戊巴比妥钠购于德国默克公司；血盾购于中国深圳泰明嘉业科技有限公司；改性葡聚糖纳米凝胶自制。

1.1.2 实验动物 新西兰兔，雄性，体重（2.5±0.3）kg，由第四军医大学动物中心提供，动物实验前适应性饲养1周，可自由觅食和饮水。合格证号：SCXK（军）2012-0007，清洁级别及饲养条件为普通级（1级）。

1.2 实验方法

1.2.1 体外凝血实验 根据文献[12]，取兔耳动脉血液，置于含有枸橼酸钠（109 mmol/L）的抗凝管中，备用。分别取2 mL血液于4个塑料离心管中，37℃水浴加热。每管加入0.2 mL氯化钙溶液（25 mmol/L），同时分别加入0.1 g改性葡聚糖纳米凝胶（自制）、0.1 g血盾、1.0 g血盾，最后一组为空白对照。凝血时间为加入样品至血液完全凝固的时间。测定凝血温度方法类似，分别取3 mL血液于2个试管中，室温下，将温度计插入血液中，加入0.2 mL氯化钙溶液后分别加入2.0 g纳米凝胶和血盾，记录凝血过程温度最高值。

1.2.2 兔耳缘静脉出血模型构建 取16只健康新西兰兔，分为4组，每组各4只，分别记为A（空白对照组）、B（医用纱布组）、C（纳米凝胶组）、D（血盾组）。用2%戊巴比妥钠35 mg/kg耳缘静脉注射将兔子麻醉。用75%医用酒精消毒后，每只兔分别于距离耳尖7 cm处切断耳缘静脉，自由出血5 s，5 s后分别撒0.05 g受试药物（纳米凝胶）、阳性对照药（血盾）、阴性对照药（医用纱布），并使用50 g的砝码作为外力进行伤口处的按压，每隔5s观察伤口的出血状况，并用脱脂棉吸附所出血液，记录吸附前后脱脂棉的重量，以此计算出血量。记录从切断耳缘静脉至不再出血的时间为止血时间，每组重复4次。

1.2.3 兔耳动脉出血模型构建 分组同“1.2.2”项下，实验方法类似于“1.2.2”项下，不同的是将耳缘静脉换为耳动脉，同时给药量变为0.1 g， 砝码仍未50 g。测止血时间并计算出血量，每组重复4次。

1.2.4 兔肝脏创面出血模型构建 分组同“1.2.2”项下，无菌条件下解剖开兔子腹腔暴露肝脏，用无菌手术刀在肝脏表面以“#”进行2 cm×2 cm面积的划伤，深0.5 cm，擦干净表面血液后，分e撒上0.1 g受试药物、阴性对照药、阳性对照药，因肝脏脆性较强，不加砝码，记录止血时间。因肝脏出血后部分血液流入腹腔内，无法准确记录出血量。每组重复4次。

1.2.5 兔股动脉出血模型构建 分组同“1.2.2”项下，无菌条件下钝性分离股动脉，轻轻用医用胶带固定，然后将股动脉切断，至股动脉喷血5 s，再分别给1.0 g纳米凝胶和血盾，医用纱布和无处理的空白对照均无法止血。记录出血量和出血时间。每组重复4次。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外凝血实验

不同剂量的纳米凝胶及血盾的体外凝血结果见图1。0.1 g的改性葡聚糖纳米凝胶23 s即可以使2 mL血液完全凝固（图1，A试管），相同用量的血盾却不能使血液完全凝固（图1，B试管），加大血盾的用量至纳米凝胶的10倍后，血液完全凝固，凝血时间为36 s（图1，C试管）。空白对照组498 s后可见少量血凝块，5 min后，依然无法使血液凝固（图1，D试管）。测定纳米凝胶及血盾凝血过程放热（图1，E、F试管），血盾接触血液后可使血液升温至55℃，而纳米凝胶的凝血过程不会放热，温度为室温23℃。

2.2 兔耳缘静脉及动脉损伤止血研究

在两种出血模型中，与空白对照及医用纱布相比，纳米凝胶及血盾止血时间显著缩短，差异有高度统计学意义（P < 0.01），纳米凝胶及血盾的出血量显著减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；纳米凝胶组的止血时间和出血量都略低于血盾组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 兔肝脏损伤止血研究

因肝脏出血后部分血液流至腹腔内，无法测定失血量，因此仅通过止血时间来评价不同组材料的止血效果。纳米凝胶的止血时间明显低于空白对照、医用纱布及血盾，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）（图3A）。从肝脏损伤后各组材料止血照片（图3B～E）中可以看出，纳米凝胶（图3D）的出血量明显少于其他组。

2.4 兔股动脉损伤止血研究

股动脉被剪断后，血液瞬间涌出，出血量很大，且有部分流入腔内，因此通过止血时间来评价止血效果。经实验，医用纱布组止血失败，而纳米凝胶和血盾可以成功止血（图4）。纳米凝胶可以在5 min内成功止血，血盾的止血时间为8 min。

3 讨论

当发生意外创伤时，机体自身可启动凝血过程，生理性止血机制主要包括三方面[13-15]：①血管收缩：损伤会引起局部快速的缩血管反应，减慢血流速度；②血小板的活化：血管破损后，血小板受到损伤部位激活因素的刺激而立即黏附、聚集在受损部位，形成血小板凝块聚集体，即初级止血；③血浆凝血因子的启动：一系列凝血因子相继被激活，同时血小板释放出大量的促凝物促进凝血酶的形成，使可溶性纤维蛋白原变为不溶的纤维蛋白，纤维蛋白在血小板的作用下形成血凝块。同时血小板的伪足伸入到纤维蛋白网内，肌动蛋白和肌球蛋白的收缩使血凝块收缩，使血栓变得更加坚实，即二级止血。虽然机体可以在出血后自发形成血凝块，但其凝血时间较长，对大出血作用微乎其微，因此需要借助外部力量进行快速止血[16]。

纳米凝胶是一种具有三维网状结构的高分子微粒，在水中溶胀而不溶解[17]。它具有纳米材料的普遍特点：比表面积大、吸附能力强[18]。因此制备的该改性葡聚糖纳米凝胶接触血液后，可以迅速吸收血液中的水分，因其吸水率比较高，其浓缩血小板及凝血因子的能力会更强，可以更快的使液态流动的血液凝固，同时其还可以加速生理性止血过程，达到有效止血的目的。

本研究通过试管法比较纳米凝胶与市售止血剂血盾的体外凝血效果。结果表明，血盾的用量至纳米凝胶的10倍后，血盾才可以使血液完全凝固，且凝血时间大于纳米凝胶。同时，纳米凝胶的凝血过程不会放热，因此不会造成伤口的热损伤。为了模拟体表的小血管出血，建立兔耳缘静脉及动脉创伤模型，其中，纳米凝胶和血盾的止血时间明显低于医用纱布及空白对照（P < 0.01）；纳米凝胶和血盾的出血量明显低于医用纱布及空白对照（P < 0.05），纳米凝胶的出血量和止血时间略低于血盾，但差异无统计学意义（P > 0.05）。说明纳米凝胶同血盾类似，对于小血管出血都具有优异的止血效果。肝脏创伤模型是为了模拟手术中，无法按压的脏器出血。肝脏类脆性脏器的出血是外科手术中的一大难题，因为无法按压、缝合、结扎，很多止血材料对肝脏出血都无效[19-21]。在兔肝脏创伤模型中，纳米凝胶的止血时间明显低于医用纱布及空白对照（P < 0.01），也明显低于血盾的止血时间（P < 0.05）。在肝脏创伤的止血中，纳米凝胶止血效果优于血盾，其原因除了纳米凝胶优异的吸水性以外，也可能与其吸水溶胀呈凝胶状薄膜黏附在伤口表面，有助于快速止血有关。为了评价纳米凝胶对大出血的止血效果，建立了兔股动脉出血模型。空白对照和医用纱布对照组均止血失败，股动脉血液不断流出，易造成动物失血过多休克或死亡。纳米凝胶和血盾均可成功止血，每组中新西兰兔存活率均为100%。且纳米凝胶的止血时间比血盾短，说明纳米凝胶对于股动脉大出血具有良好的止血效果。

综上所述，该改性葡聚糖纳米凝胶对静脉出血、动脉出血、体表出血等外伤出血及肝脏等脏器内出血有优异的止血效果，同时该纳米凝胶制备工艺简单，是一种良好的新型止血剂，在临床创伤方面有很好的应用前景。

[参考文献]

[1] Kauvar DS，Lefering R，Wade CE. Impact of hemorrhage on trauma outcome： an overview of epidemiology，clinical presentations，and therapeutic considerations [J]. J Trauma，2006，60（6 Suppl）：S3-S11.

[2] Achneck HE，Sileshi B，Jamiolkowski RM，et al. A comprehensive review of topical hemostatic agents [J]. Annals of Surgery，2010，251（2）：217-228.

[3] 王艳玲.一种新型淀粉基止血材料的制备及其性能表征[D].上海：华东师范大学，2015.

[4] 李曙光，张平，肖楠，等.战创伤止血敷料的现状及展望[J].创伤外科杂志，2009，11（4）：378-380.

[5] 叶真铭.胶原蛋白止血海绵的研制[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013.

[6] Pusateri AE，Kheirabadi BS，Delgado AV，et al. Structural design of the dry fibrin sealant dressing and its impact on the hemostatic efficacy of the product [J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2004，70（1）：114-121.

[7] Wedmore I，McManus JG，Pusateri AE，et al. A special report on the chitosan-based hemostatic dressing： experience in current combat operations [J]. J Trauma，2006，60（3）：655-658.

[8] Cox ED，Schreiber MA，McManus J，et al. New hemostatic agents in the combat setting [J]. Transfusion，2009，49（5）：248S-255S.

[9] 王婧奇.多糖/沸石复合止血材料的研制[D].上海：东华大学，2015.

[10] Fan L，Chong C. GNPs-CS/KGM as Hemostatic first aid wound dressing with antibiotic effect：in vitro and in vivo study [J]. Plos one，2013，7（8）：1-11.

[11] Zhang H，Gu CH，Wu H，et al. Immobilization of derivatized dextran nanoparticles on konjac glucomannan/chitosan film as a novel wound dressing [J]. Biofactors，2007， 30（4）：227-240.

[12] Shoffstall A，Everhart L，Varley M，et al. Tuning ligand density on intravenous hemostatic nanoparticles dramatically increases survival following blunt trauma [J]. Biomacromolecules，2013，14（8）：2790-2797.

[13] 徐_圆.介孔材料HW与微孔材料ZSM-5止血性能的比较研究[D].上海：第二军医大学，2012.

[14] Wolberg AS. Thrombin generation and fibrin clot structure [J]. Blood Rev，2007，21（3）：131-142.

[15] 汪学荣，周成兰.血液凝固机理的研究[J].肉类研究，2005（11）：45-47.

[16] 李云龙.止血材料开发及其表面功能蛋白研究[D].杭州：浙江大学，2014.

[17] Oh JK，Drumright R，Siegwart DJ，et al. The development of microgels/nanogels for drug delivery applications [J]. Progress in Polymer Science，2008，33（4）：448-477.

[18] Gupta S，Bansal R，Gupta S，et al. Nanocarriers and nanoparticles for skin care and dermatological treatments [J]. Indian Dermatol Online J，2013，4（4）：267-272.

[19] Bu Y，Zhang L，Liu J，et al. Synthesis and properties of hemostatic and bacteria-responsive in situ hydrogels for emergency treatment in critical situations [J]. ACS Applied Materials & Interfaces，2016，8（20）：12674-12683.

[20] 史军然，金静维，张秀华，等.云南白药联合磷酸铝凝胶治疗新生儿重度窒息合并胃出血的效果[J].中国医药导报，2015，12（7）：86-88，92.

[21] Behrens AM，Sikorski MJ，Li T，et al. Blood-aggregating hydrogel particles for use as a hemostatic agent [J]. Acta Biomaterialia，2014，10（2）：701-708.

（收稿日期：2017-01-29 本文编辑：苏 畅）