苦味感知研究进展

[摘要]现代科学研究认为，人类对于苦味的感知是通过舌，软颚等处的味蕾介导的。苦味受体（T2Rs）表达在组成味蕾的味觉细胞上，在苦味感知中发挥着重要作用。T2Rs是G蛋白偶联受体家族成员。关于苦味感知的分子生物学研究已有一定突破。同时，苦味也是中药五味之一。研究认为其物质基础为生物碱，苷类等苦味化合物。然而，对于苦味中药中苦味化合物在体内的作用靶点及这些靶点与疾病的预防治疗之间的潜在关系的研究领域并未涉足。本文在此将对苦味感知的相关研究进展做一概述。

关键词：苦味苦味受体中药计算机辅助药物设计

Abstract: Sientific reseaches reported that bitter sence is transfered by taste buds which locus in tougue and soft palate in mamalls. T2Rs expressed in taste receptor cells play an important roal in the bitter perception.Meanwhile,Bitter is one of the Five flavours of the Traditional Chinese Medicine(TCM). People have generally acknowledged that the bitter flavour is mainly contributed by some bitter compounds that’s alkaloids and glycosides. However,the targets of those bitter compounds are still unclear in the field of traditional medicine,so does the relationship between the targets and diseases.Therefore,the related study about the sense of bitter taste will be reviewed here.

Keywords: bitter taste T2Rs TCM CADD

中图分类号：R284 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）11-0159-4

中医药用四气五味来概括中药的药性，反映中药的药理药效。中药的五味通常指酸、咸、辛、苦、甘。苦味属于其中之一。[1]人们对产生苦味的物质基础基本达成一致，即公认为是生物碱，苷类等苦味化合物。苦味的感知主要由位于味蕾的味觉细胞上的苦味受体T2Rs介导的。（亲脂性苦味化合物和苦味盐激活胞内信号的机制可能是不同的）T2Rs，也称为TAS2Rs，属于G蛋白偶联受体超家族。[3,4]本文将对苦味受体的研究进展做简单概述，并对其在用现代科学方法解释中药苦味的研究做浅析探讨，以对中药现代化新思路抛砖引玉。

1味觉的生物学基础

1.1 味蕾及味觉细胞

味蕾是哺乳动物的一种特殊的上皮组织结构，主要分布在舌和软颚的轮廓状、叶状和菌状的上皮中。80～100个味觉细胞集聚成一个味蕾。[4]味觉细胞为形态细长的双极细胞，从味蕾的底部一直延伸到顶端味孔同口腔相通，由上皮细胞高度分化而来。[5]味觉细胞分为4种类型：①I型细胞是暗细胞，占总细胞数的55％～75％，主要为支撑及分泌功能；②II型细胞是亮细胞，占总细胞数的20％，是主要的感受接收细胞，苦味信号转导中的重要因子α-gustducin及苦味受体在这类细胞中表达[6]；③Ⅲ型细胞又名中间细胞，与神经有着突触连接，并且表达神经细胞粘连因子(NCAM)；④IV型细胞是基细胞，位于味蕾的基底部，不直接接受味觉信号刺激，但认为它为祖细胞，其他三类型细胞由其分化而来[7][8]

1.2 味觉神经纤维与味蕾的关系

菌状味蕾由颅神经Ⅶ的鼓索神经支来支配，轮廓味蕾则由颅神经Ⅸ支配．处于咽部的味蕾则由神经Ⅹ支配。上皮下神经丛位于味觉上皮下的结缔组织中。基底神经丛纤维位于味蕾的基底部。形成一种窝状着基细胞。蕾内神经纤维位于味蕾内。它们与所有味细胞有突触联系。蕾周神经纤维则位于味蕾周围。一些蕾周神经纤维从味蕾外进入味蕾里面．一些蕾周神经纤维到达上皮表面．其余的则触及味孔周围。味蕾接触到味觉刺激物，如苦味质后通过这些外周的传入神经纤维将信号从舌传至大脑神经中枢。 [5] [8]

2苦味受体基因及配体研究、苦味信号转导的重要分子及苦味信号转导

2.1 苦味受体基因及配体研究

苦味受体超家族（T2Rs）由T2R基因家族编码并选择性表达在舌及软腭上皮组织的α-味导素阳性的味觉受体细胞亚群[9]。人类的该基因家族由25个功能基因及8个假基因组成，每个基因大约有1kb长，位于第5、7、12号染色体上。[10]除了hT2R1位于5号染色体上外，其他hT2Rs都簇集在7号及12号染色体上。单个苦味基因可以编码不同的苦味受体，一个味觉细胞上可以表达很多苦味受体基因，甚至全部。但是一个苦味受体细胞不能感知区分所有的苦味化合物，而只能被很少量的苦味化合物特异性刺激。[11]已有苦味受体的特异性配基被确定。hT2R38是唯一直接与人类苦味感知变更有关的基因，是苦味质苯基硫脲的特异受体[12]；hT2R 43等位基因编码的苦味受体蛋白的35位为色氨酸残基，其与苦味中药化学成分芦荟总苷，马兜林酸等苦味质在人体的感知敏感性有关，不具有这个等位基因的人不能感知低浓度的这类苦味质[13]；hT2R 16由β吡喃糖苷激活[14]；hT2R 4可被denatonium，PROP等苦味质激活；hT2R 10可由士的宁激活； hT2R 14是唯一能感受宽范围苦味质的受体，能激活它的化合物有神经毒素，α侧柏酮，及防己苦毒宁素。[15]可见，这些配基中不乏苦味中药中的化学成分。但是，仍有很多苦味中药中的苦味化合物在体内的相应的苦味受体没有研究，同时，很多苦味受体的配基也未做研究。提示我们应当对中药中大量苦味药材的苦味化合物物质基础做深入研究，归属苦味化合物与苦味受体对应关系，用现代科学方法从分子水平上解释中药药性五味。

2.2 苦味信号转导的重要分子

2.2.1 α-味导素（α-gustducin）：苦味受体属于GPCR,其G蛋白也有α、β、γ三个亚单位组成。其α亚单位，即α-味导素（α-gustducin）是一种味觉特异性G蛋白，属于Gi亚种,分子量在60-50 kD。在脊椎动物的味觉感受中必不可少,研究显示，α-gustducin 基因敲除小鼠的单个味蕾中苦味细胞的数量和敏感性都明显降低。[9]与此同时，T2Rs选择性地在α-味导素阳性细胞中表达，但不是所有的α-味导素阳性细胞都表达T2Rs。α-味导素主要表达于口腔各个部位的味蕾中，但味蕾所处的部位不同，α-味导素的表达量也存在着差异。在叶状和轮廓味蕾中，α-味导素阳性细胞约占30％，而在菌状味蕾中，仅有约10％的味蕾细胞表达α-味导素。另外，在上腭的味蕾中也有比较多的味细胞表达α-味导素。α-味导素除在味蕾中表达外，在胃、胰脏和十二指肠的味细胞样化学感受细胞中也有表达。因而有人认为，虽然它们所处的位置不同，但α-味导素可能是化学感受细胞的一种标志。[16]

2.2.2 TRPM5：TRPM5是一种从味觉细胞中克隆的基因，属于TRP钙离子通道家族。形态学研究结果表明，TRPM5与T2R受体共存，并且证明TRPM5可以被味觉受体通过磷脂酶C(PLC)所激活。TRPM5基因敲除的小鼠表现出苦味味觉缺失。当受体受到刺激时，其编码的蛋白――TRPM5（瞬时受体势离子通道M5），在膜电势和胞内Ca2+等的调控下发生迅速失活。[17]

2.2.3 PLCβ2：PLCβ2（磷脂酶Cβ2）是由G蛋白βγ亚基调控的。研究证实，与α-味导素形成异聚体的β3γ13，调控该效应酶。在PLCβ2基因敲除的小鼠中，苦味味觉丧失；而苦味感受细胞异性表达PLCβ2基因，可以使小鼠对苦味的感觉恢复。[16，17]

2.2.4 其他：IP3（三磷酸肌醇）和PDE（磷酸二酯酶）是苦味信号转导下游重要的效应分子。IP3是一种水溶性小分子物质，与内质网膜上的特异Ca2+离子通道结合后，使贮存于内质网中的Ca2+释放至胞浆。胞内Ca2+浓度随之升高并激活了Ca2+依赖的K+和Cl-离子电流，引起细胞膜的超极化。PDE活化后能水解cAMP，解除环核苷酸(cNMP)对离子通道的抑制作用，使Ca2+离子选择性通道开放， 继而引起细胞内Ca2+离子浓度的升高，细胞膜去极化，神经递质释放。[4，16]

2.3 苦味信号转导通路

目前证实α-gustducin依赖的传导通路有两条：其一，T2Rs受体被苦味质刺激后，激活α-gustducin及PDE，降低细胞内第二信使环核甘酸(cNMP)的浓度，打开胞膜上的钙通道使细胞外钙内流，细胞内钙浓度升高，细胞膜去极化，释放神经递质。当阻断α-gustducin，细胞内环核甘酸浓度不再降低时，传导通路被阻断，证实α-gustducin在苦味传导通路中的重要作用。另一条α-gustducin介导的苦味传导通路是：α-gustducin-Gβ1-Gγ13三聚体被G蛋白偶联受体激活，使附着在细胞膜上的磷脂酶C活化，磷脂酶C导致三磷酸肌醇水平升高。三磷酸肌醇与内质网膜上的特异Ca2+离子通道结合后，使贮存在细胞内质网中的钙离子释放到胞浆中。胞内Ca2+浓度的升高激活了Ca2+依赖的K +和Cl-离子电流，引起细胞膜的超极化。拮抗剂阻断Gα1、Gβ13或磷脂酶C，该通道被阻断，说明这三种蛋白均参与了苦味的信号转导。研究发现，同一种苦味质具有多种传导途径，这些传导途径不是完全独立的，可能存在复杂的相互联系。[16]

3苦味受体结构

3.1GPCR结构特征

苦味受体（T2Rs）属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族。与其他GPCR一样是一条由氨基酸组成的多肽链。这条多肽链有七部分肽段穿过细胞膜形成七个跨膜区，它们由位于细胞内和细胞外的六个突环连接起来。跨膜区由疏水性氨基酸残基组成，以α-螺旋形式存在；六个突环由亲水性氨基酸构成。N-末端位于细胞外且很短；C-末端伸向细胞内。七个跨膜区的氨基酸序列有极大的相似性，为分子保守区，而N-末端和C-末端的区域以及细胞内和细胞外突环的氨基酸序列则变异程度较大。[18]其他胞外N端很短的GPCRs，与配体结合的受体上的重要氨基酸残基位于跨膜区，或胞外的环上，所以推测苦味受体的配体结合位点也位于跨膜区和胞外环。[3][19] T2Rs是跨膜蛋白，因不易得到晶体，难以用X射线、NMR等方法测其三维结构。笔者未见关于T2Rs晶体结构的文献报道。目前只有GPCR蛋白――牛视紫红质(bovine rhodopsin)的晶体三维结构被构建的文献报道。 [20-22]

3.2 利用计算机技术的结构研究

由上可知，苦味受体晶体结构难以获得。但是，随着计算机辅助药物设计这一边缘学科的兴起，已有科学工作者利用计算机技术模拟出了苦味受体的蛋白结构。Wely B.等人通过从头预测法和同源模建技术构建了人PTC（苯硫脲）苦味受体（即T2R38）结构并解释了人对于PTC感受敏感性差异的原因。从头预测法采用了MembStruk version 3.5计算模块；同源模建所采用的计算机模块为Quanta和Whatif，使用的模板为牛视紫红质1L9H的晶体结构。 ScanBindSite 和HierDock两个模块用来预测结合位点和结合自由能。通过构建该苦味受体模型发现结合位点不在可变氨基酸区域（及胞外突环N端，及胞内突环及C端），研究发现TM6、TM7跨膜区在人个体感知PTC差异中有重要作用。其中位于TM6的SNPA262V及TM7上的V269I的突变将导致苦味受体感受敏感性降低或丧失。但研究显示，无论对PTC感受敏感，PTC都能与受体结合，且结合自由能等同，故认为无法感知PTC是因为不能激活G蛋白，而不是因为PTC与受体的结合力减弱。[23] Laurence Miguet等人用WhatIf模块通过同源模建方法模建了PTC特异苦味受体hT2R38及PROP(丙硫氧嘧啶)特异受体hT2R16，并应用了两个分子对接软件FlexX和GOLD,并模拟了配体受体可能的相互作用。结果显示hT2R38苦味受体上3个重要的与PTC感知敏感差异性有关的SNP中，A262V在影响受体多聚形成中有重要作用，而GPCR受体多聚常与功能相关；P49A在影响突环区构象状态方面有关，而突环区分子构象在信号转导产生作用重大。但还未明确位于TM7的V296I的具体功效。并发现在配体结合过程中表面相互作用至关重要。[24]

4展望

通过关于苦味受体研究进展的学习，笔者认为对我国中药现代化工作将有重要的指导意义。中药药性理论是中药的精髓，多数中药的性能与功效统一或在很大程度上相关。如上所述，苦味受体为G蛋白偶联受体，分离纯化难度较大，且中药成分复杂多样。通过实体实验归属各味中药中的苦味化合物与苦味受体的对应关系，显然成为一项昂贵棘手的工作。然而，计算机辅助药物设计能在虚拟世界实现这种复杂的操作。计算机辅助药物设计技术也在日新月异的发展。利用从头预测法，同源模建法，折叠预测法模拟构建苦味受体的蛋白四级结构已成为一项相对成熟的技术；分子对接技术搜索配体在受体上的可能结合位点并完成配体受体契合评价；分子动力学模拟结合的动态过程等已成为计算机辅助药物设计中的常规手段与方法。目前很多天然产物的化合物结构已被小分子数据库收录，如中草药结构数据库（CHDD）,天然产物数据库（CNPD）等。我们也可以利用数据库软件依据自己研究工作的需要自建小分子数据库。将小分子数据库中的化合物分别与模建所得蛋白分子做分子对接及分子动力学模拟，便有望达到归属配体-受体对应关系的目的。与此同时，中医中药的整体观渐渐被人们接受，系统生物学领域正炙手可热。针对一味中药，在计算机上将其味觉转导机制与其药效物质所涉及的代谢及信号转导系统构建生物系统网络，模拟该味药药性药效机制也已经不再是天方夜谭。目前已有构建系统网络的相应软件上市。作者在此只是陈述个人的一些推进中药现代化的思路。中药现代化工程巨大，需要国内外科研工作者齐心协力才能推陈出新，创造佳绩。

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