RP-HPLC法测定人血浆中的替硝唑

【摘要】 目的 建立人血浆中替硝唑的检测方法。方法 采用RP-HPLC法测定人血浆中药物浓度，色谱柱为Lichrospher C18 （4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（32∶68 v/v）。结果 在0.1～80 mg•L－1范围内替硝唑峰面积与浓度线性关系良好（r=0.9996）, 最低可定量浓度为0.03 mg•L－1，绝对回收率为83.2~89.8%，准确度为93.1%~104.2%，日内、日间RSD小于10%。结论 本测定方法灵敏、准确、简便，适合于替硝唑的临床药物检测和药代动力学研究。

关键词： 替硝唑 血浆 RP-HPLC

Determination of tinidazole in humans plasma by RP-HPLC

Shen Guo-ping，Zhu derui，Long qifu，Li yaodong

(Dept. of Biochemistry,Qinghai University Medical College, Xining 810001)

Abstract AIM: To develop a simple,sensitive and rapid method for the determination of tinidazole in human plasma. METHOD: The plasma concentration of tinidazole was determined by RP-HPLC method ,the analysis involved a 250 mm × 4.6mm column packed with C18(5 um),the mobile phase consisted of methyl alcohol-water(32:68) RESULT: A good linearity was obtained in the range of 0.1～80 mg•L－1(r=0.9996),the recovery was between 83.2~89.8%, the accuracy was between 93.1%~104.2% the relative stand deviations of within-day and between day were less than 10%,the minimal detectable concentration in human plasma was 0.03 mg•L－1. CONCLUSION: The result demonstrated that the method was sensitive,accurate and simple for the determination of tinidazole in human plasma,it was suitable for the pharmacokinetics study of tinidazole.

Key words tinidazole; plasma; RP-HPLC

中图分类号：R97 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）06-0009-03

替硝唑（Tinidazole）为甲硝唑同系物，是一种新的硝基咪唑类药物，具有抗厌氧菌和抗原虫的作用，临床上主要用于治疗泌尿生殖道毛虫病及敏感厌氧菌所致的感染。与其同系物甲硝唑相比, 具有疗效好，半衰期长，疗程短，体内分布广，耐受性好等特点，但在全身用药后，仍有恶心、呕吐、厌食、腹痛等较为严重的不良反应[1-2]。本文建立了人血浆中替硝唑的反相高效液相色谱测定法，为替硝唑的临床药物检测和药代动力学研究提供一定的参考依据。

1 试药与仪器

1.1 药品与试剂

替硝唑对照品由中国药品生物制品鉴定所提供，甲醇和乙腈为色谱纯（山东禹王公司），自制纯化水。

1.2 仪器

高效液相色谱仪：日本岛津LC-10AT泵，岛津SPD-10A 紫外检测器，N2000型色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所），TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），XW-80A旋涡混合器（上海精科有限公司）。

2 方法

2.1色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18 （4.6×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（32∶68 v/v），流速1 ml•min-1，检测波长310 nm，进样量为20 μl。

2.2对照品溶液配制

精密称取替硝唑对照品10 mg置10 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg.ml-1替硝唑的储备液。以此标准储备液稀释配制成各种浓度的对照品溶液。

2.3 样品处理

取人血浆样品0.5 ml于离心管中,加入0.5 ml乙腈，涡漩1 min，16000 rpm离心10 min,取上清液20 ul，用HPLC法进行测定。在本实验条件下，替硝唑的保留时间约为5.0 min，此峰与杂质分离良好，色谱图见图1。

（Ⅰ） （Ⅱ） （Ⅲ）

Fig 1. HPLC chromatograms of human plasma(1: tinidazole)

（Ⅰ）blank plasma (Ⅱ)blank plasma spiked with tinidazole

(Ⅲ) plasma after oral administration of tinidazole

2.4 标准曲线制备及最低检测浓度测定

取离心管数支，分别加入空白血浆0.5 ml与替硝唑对照品溶液适量，配成浓度为0.1，0.5，1，5，10，25，50，80 mg•L－1的标准血浆样品，涡漩混匀后按“样品处理”项下操作，每种浓度做5份，记录峰面积。以替硝唑峰面积A对浓度C进行回归计算，得回归方程：A＝906×C－303 ，r＝0.9996。按上述条件测得人血浆中替硝唑最低检测浓度为0.030 mg•L－1。

2.5 精密度试验

按“标准曲线制备”项下操作，配制浓度为0.1，10，80 mg•L－1的替硝唑标准血浆样品，按“样品处理”项下操作,计算日内与日间精密度，结果测得低中高三种浓度血浆样品的日内RSD为10.56%，5.32%和4.12%，日间RSD为10.96%，7.76%和6.88%。

2.6 回收率试验

取离心管数支，分别加入替硝唑对照品溶液适量，以甲醇配成含替硝唑分别为0.1，10，80 mg•L－1的溶液，每份0.5 ml,以氮气吹干后，用1 ml流动相溶解残渣，精密吸取20 ul进样分析，记录色谱图得样品峰面积As。另取离心管数支，分别精密加入不同量的替硝唑对照品溶液及0.5 ml空白血浆，涡旋1 min,配成含替硝唑0.1，5，20 mg•L－1的血浆样品，每种浓度各做5份样品，按“样品处理”项下操作，记录色谱图得样品峰面积Ax。上述Ax和As的比值即为替硝唑的绝对回收率（R%）。结果测得低中高三种浓度血浆样品的回收率分别为83.2%，85.1%和89.8%。

2.7准确度试验

将前述日间精密度中0.1，5，20μg/ml系列浓度的峰面积As代入前述标准曲线方程，计算所得浓度和加入浓度的比值即为准确度。结果测得低中高三种浓度血浆样品的准确度分别为93.1%，99.5%和104.2%。

3 讨论

对比了乙腈、甲醇和乙醇等常用沉淀试剂，结果表明甲醇和乙醇沉淀蛋白不完全，且灵敏度偏低，乙腈沉淀蛋白的能力较强，故最终选择乙腈为沉淀试剂。

根据文献报道，用乙腈作沉淀试剂处理血浆样品，当乙腈与血浆的体积比为2比1时，乙腈沉淀蛋白的能力最强[3]，但经反复实验等体积的乙腈就可满足实验要求，故本文采用乙腈与血浆的体积比为1比1。

本实验干扰少，灵敏度高，替硝唑保留时间短，操作简便，适合于药代动力学研究。

参考文献

[1] 乐永其，尹玉萍.替硝唑抗厌氧菌及抗原虫作用[J].中国医院药学杂志，1994，14（2）：92.

[2] 柏干荣，胡友梅.替硝唑的药理与临床应用进展[J].中国药房，1998，9（1）：42.

[3] 曾经泽.生物药物分析[M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998，28.