低频脉冲磁场对兔膝关节软骨细胞人白介素1β、肿瘤坏死因子α表达与分泌的影响

[摘要] 目的 探讨低频脉冲磁场对兔膝关节软骨细胞人白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达与分泌的影响。 方法 选择40只健康成年新西兰白兔建立兔膝关节软骨损伤模型，把右膝关节设为治疗组（n = 20），每日给予低频脉冲磁场治疗；左膝关节为对照组（n = 20），给予假磁场治疗，治疗后1、4周深麻醉处死动物，观察相关指标的变化。 结果 在同一观察时间点，IL-1β和TNF-α表达量治疗组均明显少于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。治疗组软骨损伤程度较对照组轻微，关节活动度明显大于对照组，outerbridge积分也少于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 低频脉冲磁场治疗骨性关节炎具有简便易行，安全无创等优点，可有效遏制IL-1β、TNF-α的释放，调节分泌作用，从而对骨性关节炎软骨损伤修复具有促进作用。

[关键词] 低频脉冲磁场；兔膝关节软骨细胞；人白介素1β；肿瘤坏死因子α

[中图分类号] R683 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0032-03

膝关节骨性关节炎是指由于膝关节软骨变性、骨质增生而引起的一种慢性骨关节疾病，又称为膝关节增生性关节炎、退行性关节炎及骨性关节病等[1]。其发病一般认为可能和年龄、性别、体重、饮食、气候、关节损伤以及过度使用、骨密度、基因突变等因素有关[2]。越来越多的研究证实，其病变是由于机械性外伤或炎症等多种因素造成关节软骨损伤，而使软骨成分产生自身免疫反应，造成继发性的关节软骨破坏。低强度脉冲磁场最早应用于促进骨折的愈合[3]。研究发现，低强度脉冲磁场不仅能够促进骨折愈合，而且可以保证骨折愈合后的效果，但机制尚不明确[4]。本研究旨在通过研究低强度脉冲磁场对骨性关节炎软骨损伤中软骨细胞人白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达与分泌的影响，进一步阐明低强度脉冲磁场促进软骨损伤修复的作用机制，为低强度脉冲磁场临床应用于骨性关节炎等软骨损伤提供理论基础，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验动物：40只成熟的健康成年新西兰白兔，雌雄均半，体重2.5～3.5 kg，由我院实验动物学部提供。实验主要药品：羊抗兔IL-1β、TNF-α单克隆抗体免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），单克隆抗体IL-1β、TNF-α抗体（R&D Systems）。

1.2 动物模型的制备

将新西兰白兔后膝关节局部脱毛，氯丙嗪1 mg/kg肌内注射，氯胺酮5 mg/kg肌内注射全身麻醉。麻醉成功后，仰卧固定于操作台，常规消毒、铺巾。取膝前内侧切口，依次切开皮肤、皮下筋膜组织，暴露膝关节。按改良Hulth模型法切断膝前交叉韧带、内侧副韧带，切除内侧半月板。冲洗关节腔，缝合皮下筋膜和皮肤。术后饲养于实验动物中心，单笼单只饲养，环境温度20～25℃，湿度50%～60%。青霉素20万U/kg肌内注射，每日1次，连续5 d，每日检查石膏固定情况，并及时进行修复。

1.3 动物分组与治疗方法

造模后2周，把右膝关节设为磁场治疗组（n = 20），每日给予低频脉冲磁场治疗，磁场强度30 mW/cm2，频率1.0 MHz，频宽200 μs，重复频率1.0 KHz，每次15 min。左膝关节为对照组（n = 20），给予假磁场治疗（治疗过程同低频脉冲磁场组，磁场治疗仪不开机，探头无能量输出，为假治疗）。

1.4 膝关节活动度评价

处死动物后用量角器测量每只兔子的实验侧膝关节的被动活动度。

1.5 IL-1β和TNF-α表达检测

分别于动物模型制备治疗后1、4周深麻醉处死兔。制软骨细胞匀浆，留取上清后用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α含量。

1.6 Outerbridge评分

处死实验动物后大体观察关节液的变化，根据手术显微镜观察所见，采用Outerbridge软骨损伤评分方法进行评分。

1.7 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-1β和TNF-α表达变化比较

在同一观察时间点，两组的IL-1β和TNF-α表达量均有差异，治疗组均明显少于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 两组Outerbridge积分比较

在同一观察时间点，治疗组软骨损伤程度较对照组轻微，Outerbridge积分也少于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 两组关节活动度比较

在同一观察时间点，治疗组的关节活动度均明显大于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3。

3 讨论

骨关节炎是一种多发于中老年人的慢性进行性骨关节病，属增龄性疾病，其主要病变是关节软骨的破坏及关节边缘的骨赘形成，其致病因素多种多样，除年龄外，肥胖、超负荷运动、遗传、环境、饮食、性别等都可能是发病因素[5]。现代生物医学研究则表明细胞因子、生长因子、免疫因素等都与膝骨关节炎的发生有关[6]。骨性关节炎动物模型较多，分为自发性模型和实验性或诱发性模型，笔者采用改良Hulth骨性关节炎模型，手术切断膝关节前交叉韧带、内侧副韧带并切除内侧半月板，通过改变关节正常的力学轴线促发关节软骨变性，能很好模拟软骨损伤的终末环节，更适用于晚期骨性关节炎的研究[7]。

目前，对于骨关节炎的治疗方法较多，大体可分为手术治疗和非手术治疗。非手术治疗包括合理的休息与功能锻炼、药物治疗、物理治疗、运动疗法、注射疗法以及中医治疗等。物理治疗是指应用各种物理因子来预防和治疗疾病[8]。已有研究证实，低频脉冲在一定频率和电流下，可促进组织重排，细胞软化，激发细胞分化，促进组织新生。脉冲微波同时还有杀菌作用，对局部细菌和真菌性炎症由于吸收的浓度不同，产生不同的杀伤作用，协助抗生素的抗感染作用。同时磁场的振动产生涡电流进入组织，这些电流会产生神经轴突的去极化，并向近端和远端方向输送传递性的神经冲动。而当磁场作用于生物体时，可影响体内电子运动方向和带电离子的分布及浓度、细胞膜电位、神经的兴奋和抑制，并可使细胞膜通透性增强，加速细胞内外物质交换。磁场作用于人体，可以扩张局部血管，促进血液循环和营养物质供应，同时降低了血液黏度，改善血液流变学特性，减弱致痛物质活性和瘀滞，从而缓解疼痛。

本研究通过对各组动物关节活动度与Outerbridge积分检测结果的分析，发现随着时间的延长，治疗组的关节活动度都在不同程度的增大，主效应都是比较明显的，直接提高了受损膝关节的关节活动范围，使得关节腔内炎性积液得以较快吸收消散，使其在关节局部的含量减低。同时Outerbridge积分也逐渐降低，从而加快关节软骨的新陈代谢，间接地提高了关节局部的抗氧化能力[9]。

IL-1β、TNF-α是一种重要的促炎症因子，具有广泛的生物学效应。研究表明，膝关节损伤缺血后IL-1β、TNF-α的释放可促进骨关节实质内白细胞的浸润，进而加重炎症反应；同时，IL-1β、TNF-α能促进IL-2、IL-6、IL-8等细胞因子的合成；此外，IL-1β还可以激活释放细胞因子、自由基等参与炎症反应[10]。本文结果显示，在同一观察时间点，两组的IL-1β和TNF-α表达量都有所差异，治疗组均明显少于对照组（均P < 0.05），表明低频脉冲磁场对能有效缓解IL-1β、TNF-α的刺激释放。不过动物模型不能完全模拟人体骨性关节炎的自然病理过程，低频脉冲磁场对人体骨性关节炎的治疗效果仍需进一步的临床试验验证。

总之，低频脉冲磁场治疗骨性关节炎具有简便易行，安全无创等优点，可有效遏制IL-1β、TNF-α的释放，调节分泌作用，从而对骨性关节炎软骨损伤修复具有促进作用。

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（收稿日期：2012-04-27 本文编辑：李继翔）