时间：2022-06-03 02:21:18
【摘 要】目的：采用反相高效液相色谱法测定桂枝马钱片中士的宁和马钱子碱含量。方法：色谱柱为Hypsil Gold C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈- 0.01 mol・L-1庚烷磺酸钠与0.02 mol・L-1
磷酸二氢钾等量混合溶液（用质量分数为10%的磷酸调节pH值至2.8）（21∶79），检测波长为260 nm，
柱温为30 ℃，流速为1 mL・min-1。结果：士的宁进样量在13.60～68.00 μg・mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系（r = 0.999 9），平均加样回收率97.08%，RSD为1.63%（n = 6）；马钱子碱进样量在10.92～54.60 μg・mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系（r = 0.999 9），平均加样回收率为96.78%，RSD为1.80%（n = 6）。结论：该方法准确、重复性好、灵敏度高，可用于桂枝马钱片的质量控制。
【关键词】 桂枝马钱片；士的宁；马钱子碱；反相高效液相色谱法
Determination of the Contents of Strychnine and Brucine in Guizhi Maqian Tablets（桂枝马钱片）
with RP-HPLC
LOU Yu-xia
【ABSTRACT】Objective：To determinate the contents of strychnine and Brucine in Guizhi Maqian Tablets
（桂枝马钱片）with RP-HPLC（reversed phase high-performance liquid chromatography）.Methods：The chromatographic
column was Hypsil Gold C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was the balanced mix of acetonitrile-sodium heptanesulfonate（0.01 mol・L-1）and potassium dihydrogen phosphate（0.02 mol・L-1）（Phosphoric acid with 10% mass fraction was used to adjust the pH value to 2.8）（21∶79）.The detection wavelength was 260 nm，the column temperature was 30℃，and the flow rate was 1 mL・min-1.Results：The sample size of strychnine within 13.60～68.00 μg・mL-1 showed a good linear relationship（r = 0.999 9） with its peak area.The average recovery rate was 97.08% and the RSD was 1.63%（n = 6）.The sample size of brucine within 10.92～54.60 μg・mL-1 showed a good linear relationship（r = 0.999 9）with its peak area.The average recovery was 96.78% and the RSD was 1.80%（n = 6）.Conclusion：The method，with accuracy，good repeatability and high sensitivity，can be used for quality control of Guizhi Maqian Tablets.
【Keywords】 Guizhi Maqian Tablets（桂枝马钱片）；strychnine；brucine；RP-HPLC
桂枝马钱片是河南风湿病医院娄多峰教授的经验方，由桂枝、赤芍、制马钱子、甘草、生姜、大枣等药物组成，具有温经活血、通络止痛的作用，适用于类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、肩周炎、腰椎间盘突出症等疑难风湿病出现顽固疼痛者。制马钱子是处方中的主要药物，但有较大毒性，过量使用会引发严重的神经系统不良反应，如惊厥、抽搐、昏迷等。制马钱子所含的化学成分士的宁和马钱子碱既是有效成分，同时也是毒性成分，用量一定要精准。本研究在参考《中国药典》（2015版，
一部）[1]和相关文献[2-5]的基础上，针对桂枝马钱片中士的宁和马钱子碱2种成分，运用RP-HPLC法同时测定其含量，进而可以更好地控制其质量，为该药应用于临床时的安全性和有效性提供保障。
1 材 料
1.1 仪 器 2695型高效液相色谱仪（美国Waters，Empower工作站，2696 PAD检测器）；Mettler AE 240 电子天平（瑞士梅特勒公司）；SB-5200DT型超声波清洗器（宁波新芝有限公司）。
1.2 药品与试剂 桂枝马钱片（河南风湿病医院自制，生产批号140601、140602、140603，规格每片0.3 g）；对照品士的宁和马钱子碱（中国食品药品检定研究院，批号分别为110705-200306，含量97.0%；110706-200505，含量95.9%）；试验用甲醇、乙腈是色谱级；其余试剂是分析级；水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Hypsil Gold填料的ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国热电）。流动相：乙腈- 0.01 mol・L-1庚烷磺酸钠与 0.02 mol・L-1磷酸二氢钾等量混合溶液 （用质量分数为10%的磷酸调节pH至2.8）（21∶79）。检测波长：260 nm。流速：1 mL・min-1。色谱柱温：30 ℃。进样量：10 μL。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取马钱子碱5.46 mg、士的宁6.80 mg，放入50 mL的容量瓶内，加入三氯甲烷轻轻摇动使其溶解；再用三氯甲烷加到刻度线，摇匀作为对照品储备液。精确量取以上储备液3 mL，放入10 mL量瓶内，用甲醇定容，摇匀，即得对照品混合液（每毫升含有士的宁40.80 μg和马钱子碱32.76 μg）。
2.2.2 供试品溶液 取桂枝马钱片20片，充分研细，混匀，称取2 g，精确称定；置磨口锥形瓶中，加氢氧化钠试液5 mL，摇匀，放置30 min；加三氯甲烷25 mL，放置天平上称重；在水浴锅内加热回流2 h，取出后放冷到与室温相同；用三氯甲烷回补到起始重量，摇匀；在玻璃漏斗上铺少量的无水硫酸钠，过滤，不要初滤液；精确量取后面的滤液5 mL，放入10 mL的容量瓶内；加甲醇到刻度线，轻轻摇动，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取后续滤液即可。
2.2.3 空白溶液 依照桂枝马钱片的处方加工工艺，制成空白样品（缺少制马钱子），并按2.2.2项
下方法制成空白对照溶液。
2.3 空白样品干扰试验（专属性试验） 精确吸取按2.2项下方法制备的3种溶液各10 μL，按所选定的色谱条件测定，液相色谱图见图1。结果显示，分离度 > 1.5，理论塔板数按成分士的宁的峰进行计算不低于5000，空白溶液在化学对照品峰相同保留时间处没有出现色谱峰，表明方中其他中药材和辅料对目标成分的测定没有干扰。
2.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品储备液1，2，3，4，5 mL，分别放置于5只10 mL容量瓶内，加甲醇到刻度线，轻轻摇动，即可。精密吸取上述5种溶液10 μL，进样，绘制标准曲线（横坐标：对照品进样溶液浓度。纵坐标：与不同浓度相对应的峰面积）。得出2种成分的回归方程分别为：士的宁Y = 139 70 X + 120 85（r = 0.999 9），马钱子Y = 18 220 X + 9287（r = 0.999 9）。结果表明士的宁进样浓度在13.60～68.00 μg・mL-1、马钱子碱进样浓度在10.92～54.60 μg・mL-1范围内与相应的峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度考察 取桂枝马钱片样品，制备成供试品溶液，精密吸取10 μL，按选定的色谱条件连续进样6次。结果2种成分峰面积的RSD（n = 6），士的宁为1.7%，马钱子碱为1.9%，证明本研究所用仪器有良好的精密度。
2.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在制好后第0， 2，4，8，10，12小时，按所选定的色谱条件进行测定。结果2种成分峰面积的RSD
（n = 6），士的宁为1.5%，马钱子碱为1.5%，说明供试品溶液制备后12 h 内稳定。
2.7 重复性试验 取桂枝马钱片（生产批号140602）20片，研成细粉，平行取6份，每份约2 g，精确称定后，制成供试品溶液。按本研究确定的色谱条件测定，并进行含量的计算。结果2种成分含量的RSD（n = 6），士的宁为0.87%，马钱子碱为2.21%，证明本研究有良好的重复性。
2.8 样品中成分的含量测定 取3个不同批次的桂枝马钱片，按照上述方法制备成供试品溶液。在已选定的色谱条件下进样测定。每片含量计算，结果见表1。
2.9 加样回收率试验 取桂枝马钱片细粉（生产批号140602，含士的宁0.779 mg・g-1，马钱子碱
0.965 mg・g-1）6份，每份约3.5 g，精确称重后，分别置磨口锥形瓶中；每瓶中准确加入一定量的2种对照品，按2.2.2项下方法制备所需溶液；按选定的色谱条件，各吸取6 μL，进样测定，计算加样回收率。结果见表2。
根据制备工艺中制马钱子的加入量进行理论值推算，并参考本实验结果，暂定每片桂枝马钱片中制马钱子以士的宁（C21H22N2O2）计应在0.18～0.35 mg范围
内，以马钱子碱（C23H26N2O4）计应不少于0.20 mg。
3 讨 论
3.1 测定波长的选择 根据士的宁和马钱子成分峰的PAD吸收光谱，并参照《中国药典》（2015版，一部）马钱子项下规定的含量测定方法，选定260 nm
作为本研究色谱方法的检测波长。
3.2 流动相的选择 参照《中国药典》（2015版，一部）方法，采用乙腈- 0.01 mol・L-1庚烷磺酸钠与0.02 mol・L-1磷酸二氢钾等量混合溶液（用质量分数为10%的磷酸调节pH至2.8）系统为流动相。经过试验，当两者比例达到21∶79时，能满足系统适应性试验的要求。
3.3 提取方法的考察 在参考药典的基础上，取样品，加氢氧化钠试液放置，用氯仿回流提取制备供试液，进样测定；同时，曾采用将样品以石油醚脱脂后同法处理，进样测定，结果两者色谱图基本一致。表明没有脱脂预处理样品的必要，可能是因为本品处方较精简，干扰成分较少之故。
4 参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典（2015版）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：50.
[2] 那微，张清波，张淑华，等.HPLC法测定骨筋丸系列品种中马钱子碱和士的宁[J].中成药，2012，34（4）：759-762.
[3] 余良忠，文萍，刘丹，等.颈腰康片质量标准研究[J].中成药，2009，31（11）：1803-1804.
[4] 陈大全，李小安，王昌利，等.反相离子对高效液相色谱法测定风痛宁胶囊中士的宁和马钱子碱含
量[J].中成药，2006，28（10）：1540-1542.
[5] 梁晓东，唐迎雪，王加锋，等.HPLC测定马钱子配伍生地黄前后马钱子碱和士的宁的含量[J].中药材，2012，35（1）：79-82.
收稿日期：2016-06-15；修回日期：2016-08-10