5―氮杂―2'―脱氧胞苷对人胃癌细胞株BGC803生长及DAPK基因表达的影响

[摘要] 目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人胃癌细胞BGC803增殖、凋亡及对死亡相关蛋白激酶（DAPK）mRNA表达水平的影响。 方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理BGC803细胞，设立不含5-Aza-CdR的对照组及3个实验组：5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组。CCK-8检测细胞的增殖情况，AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测药物处理后细胞凋亡的情况，RT-PCR检测用药前后DAPK mRNA的表达水平变化。 结果 实验组BGC803细胞增殖速度显著低于对照组，细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）。RT-PCR结果显示，BGC803细胞中DAPK基本无表达，5-Aza-CdR处理后，细胞中DAPK mRNA表达量显著高于对照组（P < 0.05）。 结论 5-Aza-CdR抑制BGC803细胞增殖，并促进细胞凋亡，可能与其诱导DAPK基因表达有关。

[关键词] 5-氮杂-2'-脱氧胞苷；死亡相关蛋白激酶；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（b）-0014-04

[Abstract] Ojective To explore the effects of DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine （5-Aza-CdR） on the proliferation， apoptosis and the expression level of tumor suppressor gene DAPK in human gastric cancer cell line BGC803 cells. Methods BGC803 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR and divided into four groups， including control group， 5-Aza-CdR 1 μmol/L group，5-Aza-CdR 5 μmol/L group and 5-Aza-CdR 10 μmol/L group. Cell counting Kit-8 was employed to detect cell proliferation， cell apoptosis was measured by AnnexinⅤ/PI apoptosis detection kit， RT-PCR was applied to detect the DAPK mRNA expression. Results The proliferation of BGC803 cells was significantly inhibited in a dose-dependent manner compared with control group， after 5-Aza-CdR treatment， the apoptotic rates of cells increased significantly （P < 0.05）. The expression levels of DAPK mRNA was gradually increased in a time-dependent manner （P < 0.05）. Conclusion 5-Aza-CdR inhibited cells proliferation， promoted cells apoptosis and induced the expression of DAPK gene in BGC803 cells.

[Key words] 5-Aza-2'-deoxycytidine； Death-associated protein kinase； Gastric cancer； Cell proliferation； Cell apoptosis

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年因胃癌死亡的人数位居癌症死因第2位[1]。胃癌的发生发展是涉及多个基因的复杂过程，与抑癌基因的异常改变密切相关。肿瘤表观遗传学认为基因启动子区CpG岛甲基化是抑癌基因表达下调甚至失活的重要机制，但这种变化是可逆转的，去甲基化药物能够逆转抑癌基因启动子甲基化状态，恢复其正常表达[2]。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种凋亡正向调节分子，可被肿瘤坏死因子α、神经酰胺、细胞外基质（ECM）存活信号和pl9AFR5等多种因子激活，进而诱导凋亡[3]。有研究表明在头颈部肿瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多种肿瘤细胞中，DAPK启动子区域DNA高甲基化水平与该基因表达沉默有关[4-7]。Satoh等[8]发现15%的胃癌组织存在DAPK基因启动子区CpG岛甲基化。本文以人胃癌BGC803细胞株为研究对象，研究体外去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）对胃癌细胞株增殖、凋亡及细胞中DAPK基因的表达影响，为探讨胃癌的发生发展机制及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

BGC803细胞来源于中国医科大学遗传学教研室，5-Aza-CdR购自美国Sigma公司，CCK-8购自北京碧云天公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，总RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，GoTaq Master Mix购自美国Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及药物处理 RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100 μ/mL 青霉素，100 μ/mL链霉素）在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养BGC803细胞。培养至60%汇合度时，对照组使用不含5-Aza-CdR的普通完全培养液，实验组分别为加入不同浓度5-Aza-CdR处理液分别记为5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组，每隔24小时换液1次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖变化 将各组BGC803细胞按1500/孔接种96孔板，每组设3个复孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内孵育4 h，测定450 nm波长OD值，连测3 d，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。以上实验重复3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率变化 细胞传代24 h后，实验组将5-Aza-CdR 10 μmol/L浓度配制的培养液加入培养瓶中，对照组换普通培养掖，每24小时换液1次。待72 h后分别回收细胞，制成单细胞悬液，再用PBS离心洗涤，调整待测细胞密度为1×106个/mL。取1 mL细胞，1000 r/min， 4℃离心10 min，弃上清液，加入PBS清洗细胞2次，将细胞重悬于100 μL结合缓冲液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI轻轻混匀，避光室温孵育15 min后，加入400 μL结合缓冲液，立即FCM检测。

1.2.4 半定量RT-PCR 检测各组细胞DAPK mRNA 表达变化 用总RNA提取试剂盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L组不同处理时间（0、24、48、72 h）的细胞内RNA，用两步法将RNA逆转成cDNA后进行PCR实验，DAPK引物序列为5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），长度为343 bp。作为内参的人β-actin引物序列为5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），长度为480 bp。扩增反应条件：95℃ 5 min变性，95℃复性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon-2500 R）拍照及分析表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则使基因重新活化和表达。抑癌基因启动子区域CpG岛高度甲基化可导致相关基因表达沉默，从而直接参与、影响或调控肿瘤的发生发展过程，是癌症发生的重要机制[9]。由于DNA甲基化修饰不涉及DNA序列改变，这种改变是可逆的。5-Aza-CdR是一种高效的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，它可与DNMT不可逆性结合，具有较强的去甲基化作用，恢复表观遗传学沉默的基因的表达水平，纠正肿瘤细胞的异常生物学特征[10-11]。目前5-Aza-CdR已在临床急性粒细胞白血病的治疗中得到较成功的应用[12]。Wang等[13]报道，胃癌SGC7901和BGC823细胞经5-Aza-CdR处理后，细胞增殖明显受到抑制。本研究用不同浓度去甲基化药物（5-Aza-CdR）处理胃癌细胞BGC803细胞72 h后，发现5-Aza-CdR能明显抑制细胞的增殖。

本研究显示，5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞具有诱导凋亡的作用。肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控。DAPK是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于细胞凋亡的正调控因子，广泛参与多种途径介导的细胞凋亡[14]。在多种肿瘤中已发现DAPK基因CpG岛有不同程度的高甲基化，DAPK表达明显受到抑制[15-16]。本研究发现胃癌BGC803细胞中DAPK mRNA表达水平很弱，使用10 μmol/L 5-Aza-CdR处理细胞后，可恢复DAPK mRNA表达并呈时间依赖性升高，并且基因的表达状况与细胞的生长状况平行。由此提示，5-Aza-CdR可能通过恢复DAPK基因CpG岛的去甲基化水平，使基因恢复其转录活性，从而诱导其重新表达，发挥DAPK的肿瘤抑制作用。其具体甲基化的改变状态尚需进一步研究。

综上所述，本研究发现5-Aza-CdR抑制胃癌细胞BGC803增殖及诱导凋亡，可能与其去甲基化恢复DAPK基因表达及功能有关，这为胃癌的诊断及去甲基化治疗提供了依据。

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（收稿日期：2014-08-10 本文编辑：苏 畅）