山豆根中具有生物活性的喹诺里西啶类生物碱研究

[摘要] 采用硅胶柱色谱、制备型MPLC以及制备型HPLC等多种色谱技术，从山豆根中分离得到12个化合物，根据化合物的理化性质及波谱数据（1H，13CNMR）分析，分别鉴定为3（4hydroxyphenyl）4（3methoxy4hydroxyphenyl）3，4dehydroquinolizidine（1）， lanatine A（2）， cermizine C（3）， senepodine G（4）， senepodine H（5）， jussiaeiine A（6）， jussiaeiine B（7），（+）5αhydroxyoxysophocarpine（8），（-）12βhydroxyoxysophocarpine（9），（-）clathrotropine（10），（-）cytisine（11）和（-）Nmethylcytisine（12），化合物1～7首次从槐属植物中分离得到。通过抗病毒活性筛选发现化合物1， 3， 6～10具有抗柯萨奇病毒B3型（CVB3）活性，IC50介于012～640，SI（SI=TC50/IC50）介于 56～501。抗菌活性筛选发现化合物1， 3， 7具有抑制金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的活性，MIC分别为80， 35， 60 g・L-1；化合物1， 3， 7， 12具有抑制金黄色葡萄球菌（ATCC 33591）的活性，MIC分别为180， 75， 80， 120 g・L-1。化合物2， 6， 7具有抑制大肠埃希菌（ATCC 25922）的活性，MIC分别为10， 32， 08 g・L-1。

[关键词] 山豆根； 喹诺里西定类生物碱； 生物活性

Bioactive quinolizidine alkaloids from Sophora tonkinensis

ZHANG Yan1， HU Wenzhong2*， CHEN Xiaozhong1， PENG Yubo1， SONG Liyan1， SHI Yusheng1，2*

（1 Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Jiamusi 154007， China；

2 College of Life Science， Dalian Nationalities University， Dalian 116600， China）

[Abstract] Twelve quinolizidine alkaloids were isolated from Sophora tonkinensis by means of silica gel， preparative MPLC， and preparative HPLC On analysis of NMR spectroscopic data， their structures were established as 3（4hydroxyphenyl）4（3methoxy4hydroxyphenyl）3，4dehydroquinolizidine（1）， lanatine A（2）， cermizines C（3）， senepodines G（4）， senepodines H（5）， jussiaeiines A（6）， jussiaeiines B（7），（+）5αhydroxyoxysophocarpine（8），（-）12βhydroxyoxysophocarpine（9），（-）clathrotropine（10），（-）cytisine（11）， and （-）Nmethylcytisine（12）， respectively Compounds 17 were first isolated from Sophora L plant In the in vitro assays，the isolated compounds 1， 3， 610 exhibited potent activity against CVB3 with IC50 of 640， 325， 466， 321， 012， 023 and 160， and with selective index values（SI=TC50/IC50）of 120， 56， 130， 151， 501， 262， and 236， respectively Compounds 1， 3， and 7 exhibited activity against staphylococcus aureus（ATCC 29213）with MIC values of 80， 35， 60 g・L-1， respectively Compounds 1， 3， 7， and 12 exhibited activity against staphylococcus aureus（ATCC 33591）with MIC values of 180， 75， 80， 120 g・L-1， respectively Compounds 2， 6， 7 exhibited activity against Escherichia coli（ATCC 25922） with MIC values of 10， 32， 08 g・L-1。

[Key words] Sophora tonkinensis； quinolizidine alkaloids； bioativities

doi：10.4268/cjcmm20161215

山豆根为豆科Leguminosae植物越南槐Sophora tonkinensis Gepnep的根及根茎，主要分布于广西西南部至西北部，广东、云南和贵州也有分布。山豆根的药用功效始载于唐代《开宝本草》，近代临床常用于治疗咽喉炎、黄疸、以及心律失常等病症[1]。现代药理研究表明山豆根总提取物具有抗病毒、抗炎和抗心率失常等多种活性[2]， 对其化学成分和药理活性的研究一直深受人们关注。生物碱是山豆根中的主要活性成分，也是其药效的物质基础。山豆根中主要含有以苦参碱型、金雀花碱型、羽扇豆碱型和奥豆碱型为代表的喹诺里西啶类生物碱。该类生物碱分布较广，存在于豆科20多个属的植物中。Ohmiya S等[34]从山豆根中分离得到苦参碱、氧化苦参碱、臭豆碱、N甲基金雀花碱等。窦金辉等[5]从山豆根中分离得到槐胺碱、槐醇、槐花醇、金雀花碱、氧化槐果碱等。肖平等[6]从山豆根中分离得到5α羟基槐果碱、（+）5α，9α二羟基苦参碱、9α羟基苦参碱、（+）14α羟基苦参碱、（-）14β羟基苦参碱、（-）槐果碱以及两个新生物碱类化合物（+）14α乙酰苦参碱和（-）14β乙酰苦参碱。为了进一步研究山豆根中结构新颖、活性强的喹诺里西啶类生物碱，本文从山豆根中分离并并鉴定了12个生物碱类化合物，其中化合物1～7为首次从槐属植物中发现。以往研究表明山豆根提取物具有抗柯萨奇病毒B3型（CVB3）活性， 以及抗菌活性[7]。因此对分离得到的生物碱类化学成分进行了抗柯萨奇病毒B3型活性以及抗菌活性评价，以期寻找抗病毒活性较好的化学成分，为合理开发利用槐属药用植物资源提供科学依据。

1 材料

Inova500核磁共振仪； Agilent 1100 Series分析型HPLC， YMC C18（46 mm×150 mm， 5 μm）和 Diamonsil C18（46 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱； Shimadazu LC6AD制备型HPLC， SPD10A 紫外检测器， YMCPack ODSA（20 mm ×250 mm， 10 μm）制备色谱柱；Biotage 公司FLASH中压制备液相；薄层色谱硅胶GF254及柱色谱用硅胶（100～200目， 200～300目）。

山豆根药材于2013年10月购买于广东省广州市，经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为越南槐Stonkinensis 的根及根茎。

2 方法

21 提取与分离 取山豆根药材（10 kg）， 切片，蒸馏水回流提取3次，每次2 h， 减压回收得到浸膏（2 kg）， 盐酸酸化至pH 2， 静止过夜，取上清液过732型阳离子交换树脂，树脂常温阴干，氨水碱化树脂并阴干，氯仿回流提取树脂得总生物碱（200 g）。总生物碱经碱性硅胶柱色谱，二氯甲烷甲醇洗脱（90∶10～10∶90）， 得到Fr1～Fr5组分。组分Fr3经MPLC中压液相色谱，甲醇水洗脱（10∶90～100∶0，01%TFA， 流速30 mL・min-1）， 得到A1～A7组分。对组分A2用制备型HPLC（甲醇水流动相，20∶80， 流速5 mL・min-1）分离纯化得到化合物1 （10 mg，tR=15 min）和化合物10 （5 mg，tR=17 min）。组分A3用制备型HPLC（甲醇水，30∶70， 5 mL・min-1）分离纯化得到化合物2 （3 mg， tR=25 min）， 化合物11 （5 mg， tR=28 min）和化合物12 （6 mg， tR=30 min）。组分Fr5经MPLC中压液相色谱，甲醇水洗脱（10∶90～100∶0，01%TFA， 流速5 mL・min-1）， 得到D1～D8组分。对组分D2用制备型HPLC（甲醇水，40∶60， 流速 5 mL・min-1）分离纯化得到化合物3 （8 mg， tR=30 min）和4 （9 mg， tR=32 min）； 对组分D3用制备型HPLC（甲醇水流动相，45∶55， 流速5 mL・min-1）分离纯化得到化合物5 （10 mg， tR=40 min）和化合物6 （6 mg， tR=46 min）； 组分D5用制备型HPLC（甲醇水流动相，70∶30， 流速5 mL・min-1）分离纯化得到化合物7 （7 mg， tR=39 min）， 8 （10 mg， tR=50 min）和9 （6 mg， tR=51 min）。

22 活性测试 于96孔培养板内接种Vero细胞， 24 h后使细胞感染柯萨奇病毒B3型（CVB3）10×10-5。吸附2 h后去掉病毒液， 将样品和阳性对照药稀释为不同浓度做为维持液加入到板内， 同时设空白对照组。 病毒对照组病变程度（CPE）达4+时，观察各组细胞病变程度（CPE）， 用ReedMuench法计算样品对柯萨奇病毒B3型半数抑制浓度（IC50）。

于96孔板中加入受试样品100 μL， 将样品二倍稀释至各种所需浓度， 样品终浓度分别为128，64，32……003 mg・L-1。接种试验菌（接种量为105 cfu/mL）后置35 ℃恒温培养18 h观察结果， 无菌生长的孔中所含药物的最小浓度即为最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration， MIC）。菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）， 金黄色葡萄球菌（ATCC 33591）和大肠埃希菌（ATCC 25922）。

3 结构鉴定

抗菌活性筛选发现化合物1， 3， 7具有抑制金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的活性，MIC分别为80， 35， 60 g・L-1；化合物1， 3， 7， 12具有抑制金黄色葡萄球菌（ATCC 33591）的活性，MIC分别为180， 75， 80， 120 g・L-1。化合物2， 6， 7具有抑制大肠埃希菌（ATCC 25922）的活性，MIC分别为10， 32， 08 g・L-1。

[参考文献]

[1] 范健，吕建峰山豆根的化学成分与药理研究进展 [J] 实用医技杂志， 2000， 10（11）： 1254

[2] 李希新山豆根的研究概况[J]山东中医药大学学报， 2000， 24（3）： 235

[3] Ohmiya S， Otomasu H， Haginiwa J， et al The alkaloid constituents of Euchresta japonica and the stereochemical assignment of two isomeric sophoridine Noxide [J] Chem Pharm Bull， 1980， 28（12）： 27

[4] Ohmiya S， Higashiyama K， Otomasu H， et al（+）5α， 9αDihydroxymatrine， a new lupin alkaloid from Euchresta horsfeldii[J] Phytochemistry， 1979， 18（4）： 645

[5] 窦金辉，李家实，阎文玫，等山豆根生物碱成分的研究[J]中国中药杂志， 1989， 14（5）： 40

[6] Xiao P， Kubo H， Komiya H， et al Lupin alkaloids from the roots of Sophora tonkinensis[J] Chem Pharm Bull， 1999， 50（1）： 189

[7] Wang Y H， Li J S， Kubo H， et al Lupin alkaloids from Chinese Maackia hupehensis [J] Chem Pharma Bull， 2000， 48（5）： 641

[8] Luo Y G， Li B G， Zhang G L A new quinolizidine alkaloid from Boehmeria siamensis [J] Chin Chem Lett， 2001， 12（4）： 337

[9] Neto A T， Oliveira C Q， Ilha V， et al Quinolizidine alkaloids from Lupinus lanatus [J] J Mol Struct， 2011，1004（1/3）： 174

[10] Morita H， Hirasawa Y， Shinzato T， et al New phlegmaranetype， cernuanetype， and quinolizidine alkaloids from two species of Lycopodium [J] Tetrahedron， 2004， 60（33）： 7015

[11] Máximo P， Lourenc A New quinolizidine alkaloids from Ulex jussiaei [J] J Nat Prod， 2000， 63（2）： 201

[12] Pan Q M， Li Y H， Hua J， et al Antiviral matrinetype alkaloids from the rhizomes of Sophora tonkinensis [J] J Nat Prod， 2005， 78（7）： 1683

[13] Sagen A， Gertsch J， Becker R， et al Quinolizidine alkaloids from the curare adjuvant Clathrotropis glaucophylla [J] Phytochemistry， 2002， 61（8）： 975

[14] Takamatsu S， Saito K， Ohmiya S， et al Lupin alkaloids from Sophora exigua [J] Phytochemistry， 1991， 30（30）：3793