组建乳酸菌营养陷型途径分析

本文作者：侯亚薇 王红 张兰天 毛琏 单位：河北省食品质量监督检验研究院

乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，它包括乳杆菌（Latobacillus）、乳球菌（Lactococcus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等至少23个属，与人类关系密切并广泛存在于自然界中[1]。近年来，随着乳酸菌分子生物学的迅速发展，一系列乳酸菌基因表达受体载体系统逐步建立，乳酸菌基因工程菌在功能食品、医疗保健及微生态制剂等领域的应用均具有广阔的前景。目前，人们利用现代基因工程技术来改造乳酸菌，增强其生理功能或赋予其某些新的生物学性状，获得生产性能更好或保健功能更强的优良菌种，这种优良菌种具有很好的应用性[2]。然而，遗传改造的载体系统多携带抗生素抗性基因作为外源基因稳定表达的选择压力，可使耐药性基因在菌株间水平转移和扩散。建立食品级标记的表达系统，用对人体和环境安全的食品级筛选标记替代抗性筛选标记可以解决上述问题。乳酸菌食品级基因表达系统必须具备如下条件：（1）载体必须是食品级载体；（2）表达宿主必须是安全、特性清楚而稳定的食品级微生物；（3）诱导物必须是食品级诱导物[3-4]。目前可在乳酸菌中使用的食品级筛选标记都是来源于乳酸菌或是长期安全应用于食品的。乳酸菌食品级选择标记分为两类：显性选择标记和互补选择标记[5]。各种筛选标记都有优缺点，特别是某些筛选标记具有选择压力局限性问题。互补选择标记是利用质粒选择标记补充宿主染色体中的缺失突变，从而恢复宿主原来的某种特性，并根据这一特性进行选择。互补系统的明显有利之处就是在工业发酵期间的选择压力下能确保质粒的稳定性。asd[6]互补选择标记、lacF[4]互补选择标记和glnA[7]食品级互补选择标记等属于互补选择标记。thyA[8]选择标记就属于互补选择标记，它是一种广泛存在于噬菌体、原核细胞和真核细胞中的管家基因[9-10]。胸苷酸合成酶对人类无毒无害，也不会影响肠道菌群结构。综上所述，选择机理简单易懂且选择压力稳定的thyA互补选择标记是较为理想的食品级表达系统。建立食品级表达系统的一个关键因素就是要有食品级的宿主菌，构建thyA营养缺陷型受体菌可解决这一关键因素问题。将从传统诱变筛选与Red同源重组构建thyA营养缺陷型菌株的机制出发，进一步对比分析两种方法的应用前景。

1乳酸菌thyA基因突变菌株的选育

1.1乳酸菌thyA基因突变菌株的选育机制thyA是编码胸苷酸合成酶（Thymidylatesynthase）的基因，在DNA合成中起关键作用。它可催化dUMP向dTMP的转化。dTMP是合成DNA的基本原料dTTP的前体，同时使5,10-甲基四氢叶酸转变为7,8-二氢叶酸。胸苷酸合成酶缺陷的突变株依靠外源胸苷酸或胸腺嘧啶核苷进行DNA的生物合成过程，或通过转入含有完整thyA基因的质粒以互补其功能缺陷。若此突变株生存环境不能提供足够浓度的胸苷酸或胸腺嘧啶核苷，且突变株不含相应基因的质粒，突变株将不能正常生长甚至死亡[11-12]。通常thyA基因突变株可直接从抗叶酸药物的乳酸菌菌株中筛选出来。.

1.2乳酸菌thyA基因突变菌株的选育过程

首先，选择并活化所需筛选的菌株。其次，选择适合此菌株生长与选育的基础培养基和选择培养基。在基础培养基中将待筛选的乳酸菌菌株培养至对数生长期，取其适当涂平板量涂于选择培养基上。缺陷型菌株在选择培养基上的生长速度优于野生型菌株，挑取在选择培养基上生长速度较快的菌株进行鉴定。thyA基因突变菌株在基础培养基上不生长或生长不良而在含有胸苷酸或胸腺嘧啶核苷的培养基上恢复正常生长状态。

1.3举例此方法已选育出的thyA基因突变菌株根据文献报道[13]，用此方法选育出的菌株有：大肠杆菌（Escherichiacoli）、霍乱弧菌（Bacilluscomma）、蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）、乳酸杆菌（Bacillusacidilactici）、嗜酸假单胞菌（Eosino-PS）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）和苜蓿根瘤菌（Lucernebacteria）等。在国内选育乳酸菌thyA基因突变菌株方面，傅晓丽用此法筛选得到一株嗜酸乳杆菌（Bacillusacidophilus），王春凤[14]也用此法筛选得到了嗜酸乳杆菌。但乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）等其他乳酸菌菌株未发现相关文献报道。

2Red同源重组系统构建thyA基因缺陷型菌株

2.1Red同源重组系统的作用机制Red重组系统属于λ噬菌体的同源重组系统，它在exo（α）、bet（β）、gam（γ）三个基因编码的Exo、Bet、Gam三种蛋白作用下执行重组功能。Exo蛋白是一种λ核酸外切酶，它可以结合在双链DNA的5’端，从5’端向3’端降解DNA，产生3’突出端[15]。Bet蛋白是一种退火蛋白，它可与单链DNA结合并介导互补单链DNA退火[16-17]。Gam蛋白是一个分子量为16kDa的多肽，它可以和宿主的RecBCD蛋白结合形成二聚体，从而抑制RecBCD蛋白的降解外源DNA的活性[18-19]。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入和点突变等操作，直接将目的基因克隆于载体上。

2.2利用Red系统构建thyA缺陷型的简要步骤以乳酸乳球菌MG1363为例，进行合适的PCR引物设计，引物Pa的5’末端可以设计为50bp与靶thyA基因5’端同源，3’末端与抗性基因如氯霉素同源。引物Pb的5’末端可以设计为50bp与靶thyA基因3’端同源，3’末端与抗性基因如氯霉素的另一端同源。选择合适的PCR条件，对引物进行扩增。用原生质体电转化的方法将含有Red系统的质粒Pkd46电转入MG1363，并在转化子培养结束前1h加入阿拉伯糖诱导Red系统表达相应蛋白。接下来只需要将引物的PCR产物导入受体菌中，并在选择培养基中筛选转化子即可。若要去除筛选基因，可利用位点特异性重组酶系统如Flp来去除抗性基因。基因片段打靶示意图如图1所示。

2.3Red同源重组系统的应用举例Red同源重组系统目前主要应用于大肠杆菌的基因敲除工作，其中就包括应用于大肠杆菌thyA[20]缺陷型的构建，还有对大肠杆菌ptsG[21]、ClpP[22]、asd[23]、aroL和aroK[24]等基因的敲除工作。此外，Muyrers等在沙门氏菌（Salmonella)[25]、王恒梁等在痢疾杆菌（Bacillusdysenteriae)[26]和酿酒酵母（Saccharomycessp）中[27]均应用了Red同源重组系统。

3分析与展望

对比上述两种构建乳酸菌thyA缺陷型菌株的方法步骤，可以发现：虽然传统突变育种的选育机制和选育步骤简单易懂，但其存在明显不足。首先，突变育种的工作量较大，耗费时间较长。其次，构建乳酸菌thyA缺陷型菌株，需要选择合适的基础培养基抑制乳酸菌缺陷菌株的生长，在加入胸苷酸或胸腺嘧啶核苷后又可恢复生长，这是一个比较困难的选择过程，若选用熊衍文博士设计的SA培养基无疑会增加试验成本。最后，选育出的乳酸菌突变株很容易发生回复突变，缺陷型性状不稳定。Red同源重组系统与传统突变育种相比，其具有适用范围广、操作策略灵活、试验周期短、缺陷型菌株稳定性强、回复突变率低等优越性。Red同源重组系统与其他基因操作相比，具有所需同源序列短（40~60bp）；重组效率高；可在靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入和点突变等操作；无需使用限制性内切酶和连接酶；可进行大片段克隆并无需进行长链PCR及寻找合适的酶切位点；重组发生在细胞内，克隆分子完全忠实亲代分子。可见，将Red同源重组系统用于构建乳酸菌thyA缺陷型菌株具有可行性且拥有很好的优越性。它将带来一场基因遗传工程领域革命，大大推动基因功能组研究的发展。