复方克林霉素磷酸酯维A酸凝胶抑菌效力测试与评价

摘要： 目的：考察复方克林霉素磷酸酯维A酸中所添加的抑菌剂是否合理。方法： 取样品适量接种5种代表微生物，分别在0h、24h、48h、7d、14d、28d测试微生物存活情况，评判所添加抑菌剂的抑菌效力。结果：复方克林霉素磷酸酯维A酸处方中所添加抑菌剂对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉等4种代表试验菌均无较好的抑制作用。结论： 建议重新考查处方中抑菌剂的种类及添加量。

关键词：复方克林霉素磷酸酯维A酸；凝胶制剂；抑菌效力

抑菌剂（也称防腐剂） 是一类防止或限制微生物生长与繁殖的化学药品， 其主要作用是保证药剂质量， 防止药剂的微生物污染。如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂[1，4]。复方克林霉素磷酸酯维A酸凝胶为多剂量外用凝胶制剂，主要对革兰阳性球菌及厌氧菌有较强的抗菌活性，为窄谱抗生素[2]。由于其在使用过程中存在多次打开包装有被污染的风险，其处方中需要添加一定量的抑菌剂，而所有的抑菌剂都有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量[1]。目前国内对凝胶制剂抑菌效力研究这方面的报道较少。本文采用适宜的方法对该产品进行了抑菌效力测试，考察复方克林霉素磷酸酯维A酸处方中所添加的抑菌剂是否安全有效。

1仪器与材料

1.1 仪器

隔水式电热恒温培养箱（重庆四达实验仪器厂，WGP-600）；生化培养箱（上海一恒科技有限公司，LRH-250）；生物安全柜（上海力申科技仪器公司，HF Safe 760s）；比浊仪（美国生物梅里埃公司，Densi CHEK Plus）；封闭式集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司，HTY-2000）；薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司，FC-752）。

1.2 培养基

胰酪胨大豆琼脂（TSA）培养基（批号121209），胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基（批号120108），沙氏葡萄糖液体（SDB）培养基（批号110411），沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基（批号 110718），0.1%蛋白胨水溶液（批号110221），PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号110718），（以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。培养基适用性检查实验结果符合《中国药典》2010年版要求。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102] ，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]以上菌株均源自中国医学细菌保藏中心，验证试验所用的菌株均为第2代。

1.4供试品

复方克林霉素磷酸酯维A酸凝胶（批号，111121-1，111121-2，111121-3）由北京XX生物技术有限公司提供。

2方法与结果

2. 1 计数方法学验证实验

2.1.1 供试液制备

取供试品10g，加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制备成1：10供试液。

2.1.2计数方法

复方克林霉素磷酸酯维A酸本身对革兰阳性球菌及厌氧菌有较强的抗菌活性，因此，微生物计数试验时，应采用薄膜过滤法消除抑菌活性[3]。

取制备好的1：10供试液1mL，加入含50mL0.1%蛋白胨水溶液的薄膜过滤器中，全部通过薄膜过滤器后用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，100mL/次，在最后一次冲洗液中分别加入50～100cfu金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌液，取膜贴至TSA平板，置35℃培养48小时进行细菌计数验证方法，结果见表1。

取制备好的1：10供试液1mL和50～100cfu的白色念珠菌和黑曲霉菌试验菌液，立即注入45℃融化的SDA培养基15～20mL，摇匀，凝固后，置25℃培养72小时进行真菌和酵母菌计数方法验证，结果见表1。

通过3次独立的平行试验，采用薄膜过滤法（冲洗量300mL/膜）进行细菌计数，结果金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的回收率均高于70%，说明采用薄膜过滤法可有效去除抑菌活性；采用平皿法（1mL/皿）进行霉菌和酵母菌数计数，结果白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均高于70%。

2.1.3结果

采用薄膜过滤法（取1：10供试液1mL，薄膜过滤，冲洗量300mL/膜）进行细菌计数，采用平皿法（1mL/皿）进行霉菌和酵母菌数计数。

2. 2抑菌效力测试实验

2.2.1供试液制备同2.1

2.2.2菌悬液制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌至胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基中，35℃培养18～24小时，再从TSB培养基中取新鲜培养物至胰酪胨大豆琼脂斜面（TSA）， 35℃培养18～24小时，以0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为108cfu的菌悬液；接种白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂（SDA）斜面，25℃培养24～48小时，以0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为108cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，20～25℃培养5～7天后，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌量约为108cfu的孢子悬液。

2.2.3制备方法

由上表可知，将定量比浊的菌悬液金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌菌悬液及黑曲霉孢子悬液各100μL接种至10mL1：10的复方克林霉素磷酸酯维A酸凝胶中，金黄色葡萄球菌在接种后7天下降5.4lg，出现明显的减少，表明本产品对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，说明本品在使用、储存过程中不易被此种菌污染。大肠埃希菌在接种后24小时、48小时、7天、14天、28天在0.6lg范围内浮动，铜绿假单胞菌在接种后14天增加了0.6lg，14天到28天基本无变化，表明本品中所添加的抑菌剂对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌无较好的抑制作用。白色念珠菌菌悬液在接种后14天增加了0.8lg，黑曲霉孢子悬液保持数量级不变，说明本品中所添加抑菌剂的量对霉菌及酵母菌无抑制作用，本品在使用、储存过程中易被污染。

试验结果表明供试品对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，呈现明显的下降趋势，而对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌无明显作用，且铜绿假单胞菌在试验过程中还有增加的趋势。放置过程中对真菌作用也不明显，白色念珠菌有增加的趋势，说明该药物中所添加的抑菌剂不符合抑菌剂作用范围广泛、防腐起效迅速的要求[4]，产品在使用过程中有被污染的风险，无较强的抑制污染菌生长的作用。建议在处方中加入防腐剂的最小有效量或对种类另做考察，以确保该药在使用过程中的安全有效。

3讨论

本供试品为凝胶制剂，铝管包装，每支15g。由于其包装剂型的特殊性无法直接接入原包装中，故采用将其取出制备供试液。试验采用经过方法验证的方法即细菌采用薄膜过滤法，真菌采用平皿法进行测试。为保证实验结果的客观性，实验采用菌液在0.9%氯化钠溶液中的放置同步测定，以及供试品组0时测定值两组对照判断供试品组菌数变化情况，并增加了1天、2天两个取样时间点，比较供试品对不同菌株的抑菌效力差异。

考虑到实验过程平行性，实验所用样品采用3批同步操作，取均值报告。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典[S].2010年版，二部附录XIX N，2010：215.

[2]李海涛，于学珍，林家红.复方克林霉素磷酸酯凝胶的制备及质量控制.药学进展，2006，30（6）：270-273.

[3]丁，功丽萍，谢元超.阿奇霉素滴眼液抑菌剂筛选与抑菌效力研究[J].中国药品标准，2012，13（4）：281-284.

[4]张新妹，胡昌勤，姜彩辉等.滴眼剂中防腐剂的合理应用[J].广东药学院学报，2003，19（3）：268-269.