基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值

[摘要] 目的 探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值。方法 回顾性分析685例结核病临床疑似病例的临床资料，采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术进行检测。 结果 本组685例临床疑似病例中，阳性135例，阳性率为19.7%，基因芯片检测结果显示结核131例，非结核4例，阳性率为19.1%。耐药基因检测68例，利福平和异烟肼基因突变12例，总突变率为17.6%，其中11例为利福平和异烟肼均耐药，双重基因突变率为16.2%，另1例只耐利福平。利福平总突变率为17.6%，异烟肼总突变率为16.2%，耐多药率为16.2%。 结论 晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术用于临床诊断结核病及其耐药性，能够缩短诊断时间，提高临床时效性，值得推广应用。

[关键词] 结核分枝杆菌；基因芯片；结核病诊断

[中图分类号] R378.91+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（b）-0123-03

国内每年有将近13万人因结核病死亡[1]，且有将近12万新发耐多药结核病患者，未来数年内可能出现耐药菌为主的流行态势[2]。目前，结核病诊断的标准方法主要包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，但是其普遍存在特异性差、灵敏度低或需时长的缺点[3]，本院引进国内最新的结核诊断技术——晶芯结核分枝杆菌生物芯片诊断系统，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法[4]，其应用于临床诊断结核病，提高了时效性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2013年3月1日～2013年9月30日接受诊治的结核病临床疑似病例共685例，其中男性363例，女性322例；年龄9～76岁，平均（34.51±2.28）岁；其中临床诊断结核病病例681例，包括185例痰结核菌培养阴性肺结核，157例痰结核菌培养阳性肺结核，193例结核性脑膜炎，95例结核性胸膜炎，51例骨结核。非结核分枝杆菌病4例。

1.2 试剂与仪器

Extractor 36核酸提取仪、BioMixerⅡ芯片杂交仪、Slider Washer芯片洗干仪、LuxScan 10 K-B芯片扫描仪、晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、晶芯结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，均购自博奥生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的处理 以痰样本为例（其余样本同痰样本处理方法）：①向痰液中加入等体积10%NaOH，涡旋振荡，充分液化均匀，也可37℃液化30 min后再振荡；②取1 ml液化后的痰液转入1.5 ml Eppendorf管中，12 000 r/min，5 min，弃去上清；③加入1 ml生理盐水，涡旋振荡后12 000 r/min，5 min，弃去上清。

1.3.2 核酸提取 ①向处理好的标本管内加入80 μl核酸提取液，用加样器混匀后转入核酸提取管内；②用核酸快速提取仪振荡10 min，然后95℃水浴5 min。

1.3.3 PCR扩增 ①从B试剂盒取出PCR扩增试剂，自然解冻后轻摇，迅速离心后分装18 μl至八联排管中，加上盖，标上编号；②加入2 μl样本核酸溶液，用加样器吸打混匀；③上机扩增。

1.3.4 芯片杂交 ①将PCR产物置PCR仪扩增95℃变性5 min，随后立即放入冰水混合物中，骤冷冰浴3 min；②取9 μl杂交缓冲液至八联排管中，再按样品顺序加6 μl PCR产物；③准备杂交盒，将14 μl杂交混合物加入芯片点阵中，完成后且金属封条密封杂交盒；④放入杂交仪内50℃杂交2 h；⑤将芯片洗干，甩水。

1.3.5 芯片扫描结果判读 开启扫描仪，预热激光10 min，输入芯片编号，样本信息，选择样本，开始扫描，并判读结果。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌基因芯片检测对结核病的诊断结果

本组结核菌基因检测685例临床疑似病例中，阳性患者135例，阳性率为19.7%，通过基因芯片检测结果显示，结核患者131例，非结核患者4例，阳性率为19.1%。

2.2 结核分枝杆菌基因芯片法耐药基因变异的检测结果

随机选取68例阳性患者进行耐药基因检测，通过基因芯片检测结果显示，12例患者发生基因突变，总突变率为17.6%；其中11例患者为利福平和异烟肼双重基因突变，双重基因突变率为16.2%，另1例只发生利福平基因突变；耐多药率为16.2%。利福平总突变率为17.6%，其中9例为531（C-T）位点突变，3例为526（C-T）位点突变；异烟肼总突变率为16.2%，其中7例患者为katG 315（G-C）位点突变，3例为inhA-15（C-T）位点突变，1例为katG 315（G-A）位点突变。

3 讨论

结核病严重危害人民群众的身心健康，已经成为全球共同关注的重大社会问题和公共卫生问题[5]。目前，结核病诊断的主要方法包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，存在极易漏检、敏感性低或时效性差的问题，培养法需要4周左右才能获得结果，而药敏试验法则需要8周，耐药性不能尽早检出结果，不仅会严重延误诊断，更会引起临床治疗推迟，甚至导致治疗失败[6]，同时，也助长了耐药结核分枝杆菌的传播及流行，可能造成出现耐多药结核，从而加剧了预防和控制结核病的艰巨性，因此，临床上能够找到快速诊断结核感染和耐药结核病的新型诊断工具对结核预防控制的有效性有重大意义[7]。目前，基因芯片技术已经被应用于临床，其具有特异性强、灵敏度高、快速检测和高通量的特点，为有效预防和控制结核病提供了一个新的快速、高效、实用的分子诊断平台[8]，同时为结核病的筛查、合理用药和疫情监控提供了准确且高效的应用指导。

本院采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片诊断系统诊断结核病，是博奥生物与结核病国家参比实验室经过对分枝杆菌菌种快速鉴定和结核耐药快速检测开展的合作研究，研制的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒和结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，是国内最新的结核诊断技术。与传统的检测方法相比，基因芯片法具有检测时间短和通量高的特点[9]。分枝杆菌菌种鉴定试剂盒能够快速检测结核等17种临床上多见的分枝杆菌，结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒能够快速检测利福平和异烟肼的耐药性，同时可将6～8周的常规检测时间缩减到6 h[10]，这两款试剂盒能够成功应用于临床实践，明显缩短了复杂疑难疾病的确诊时间，同时对结核耐药做到早期筛选，并可指导患者合理用药。

晶芯结核分枝杆菌的菌种鉴定和耐药基因检测采用的是DNA微阵列芯片技术，可通过对常见临床样本中的分枝杆菌核酸进行检测，快速获取临床常见致病分枝杆菌的准确种属信息。该产品主要用于结核病和非结核分枝杆菌病的辅助诊断，也可用于流行病学调查等领域，具有灵敏、准确、快捷、先进、高效的特点。

综上所述，采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片诊断系统用于临床诊断结核病及其耐药性，能够缩短诊断时间，提高临床时效性，得到了良好的社会效益，值得推广应用。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-10-18 本文编辑：许俊琴）