CRELD1基因在汉族完全型房室间隔缺损患儿心肌组织表达情况的初步分析

摘要：目的 探讨CRELD1基因在完全型房室间隔缺损（CAVSD）患儿心肌组织中的表达情况。方法 实验组选取CAVSD患儿5例，平均年龄1.2岁；对照组选取室间隔缺损（VSD）患儿5例，平均年龄1.9岁。患儿手术过程中剪取右心房适量心肌组织，应用基因芯片技术对两组标本CRELD1基因表达进行检测，比较两者差异。结果 CRELD1基因在两组病例的表达差异无统计学意义。结论 CRELD1基因在CAVSD与VSD患儿心肌组织中表达情况近似，提示CRELD1基因可能与多种先心病相关，或者CAVSD可能是一种多基因的遗传性疾病。

关键词：完全型心内膜垫缺损；CRELD1基因；基因芯片；基因表达

中图分类号：R725.4 R259 文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.019

文章编号：1672-1349（2014）04-0419-03

完全型房室间隔缺损（complete atrioventricular septal defect，CAVSD），是指左、右房室腔共用一组房室瓣，同时存在相邻的原发性房间隔缺损和室间隔缺损（VSD），占所有先天性心脏病（先心病）的2%左右，约70%的患儿合并先天愚型[1-3]。CAVSD的发生机制尚未明了，心脏的房间隔下部、室间隔上部以及二尖瓣、三尖瓣等组织均由胚胎早期的房室心内膜垫发育而成，任何可以影响心内膜垫发育环节的因素都可能导致CAVSD。随着分子生物医学理论研究与技术的突飞进展，人们逐渐认识到基因结构和表达异常在先心病的发生发展中起着重要的作用。国外研究发现CRELD1（cysteine -rich with EGF-like domain1）基因突变与白种人CAVSD发病相关，国内陈璇等[4，5]也对CRELD1的突变和过表达进行了研究。基因芯片技术[6]是以综合、全面、系统的观点来研究生命现象的一种实验方法，可以从全局理解基因功能和基因之间的相互关系及发病机制。本实验拟采用基因芯片技术，对CRELD1基因在CAVSD患儿心肌表达情况进行研究，探讨CRELD1基因在汉族CAVSD患儿心肌组织中基因表达情况，进一步揭示CAVSD发生、发展的内在分子机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2012年2月―2012年8月在我科行根治手术的CAVSD患儿10例，分为实验组（CAVSD组）和对照组（VSD组），每组5例，平均年龄分别为1.2岁（8.8个月至1.9岁）和1.9岁（1.0岁～2.7岁）。所有患者均在术中剪取适量右心房切口边缘心肌组织样本。因健康儿童心肌组织无法获取，所以用VSD患儿作为对照组。为使对照组尽可能接近正常儿童，VSD患儿还需满足：①心胸比≤0.6；②VSD缺损≤5mm；③经皮血氧饱和度（SpO2）≥95%；④不合并其他心脏及心外畸形，无先天性心脏病家族史。所有患儿术前均经超声明确诊断并于术中进一步确诊。本实验设计经我院伦理委员会审查通过，患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 主要试剂、耗材和仪器 试剂：Eukaryotic Hybridization Control Kit（900454，Affymetrix）；Hybridization，Wash and Stain Kit（900720，Affymetrix）；Tough-Spots，Label Dots（9185，USA Scientific）；MessageAmpTM Premier RNA Amplification Kit（1792，Ambion）。耗材：一次性吸头（0.5 μL～10 μL，2 μL～200 μL，100 μL～1 000 μL，Axygen）；一次性薄壁离心管（0.2 mL，1.5 mL，Axygen）；Tough-Spots，Label Dots（9185，USA Scientific）。仪器：超净工作台（CJT-16，北京长城）；微量台式离心机（5415D，Eppendorf）；涡旋混合器（TDX-1，TonDa）；移液器（P-2，P-20，P-200，P-1000，Eppendorf）；离心管架（0.2 mL，0.5 mL～1.5 mL，江苏三和金冠）；冰箱（BCD-223N，美菱）；制冰机（SIM-F124，三洋）；紫外分光光度计（ND-1000，NanoDrop）；凝胶成像仪（GDS-7600，UVP）；恒温金属浴（CHB-202，BIOER）；PCR仪（PTC-225，MJ）；Magnetic Stand-96（AM10027，Ambion）；Hybridization Oven 640（640，Affymetrix）；Fluidics Station 450（450，Affymetrix）；GeneChip Scanner 3000（3000，Affymetrix）。

1.3 实验步骤

1.3.1 心肌标本的制备 术中切取适量右心房切口边缘心肌组织，灭菌生理盐水冲洗后，离体1 min内迅速置于冻存管内，3 min内转至液氮罐中保存。所有操作均在无菌无酶条件下进行。

1.3.2 心肌组织总RNA提取 将在液氮储存的心肌组织放入盛有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，直至组织呈粉状，再加入50 mg组织/1 mL Trizol试剂继续研磨，待液氮挥发后，用移液器反复吹打数次，装入EP管中。按Trizol法说明书进行，直至提取好总RNA，置于-20 ℃备用。

1.3.3 样本总 RNA的质检 样本搜集数量达到实验所需数目后，进行质检（博奥公司提供），包括琼脂糖凝胶电泳总RNA的完整性，用分光光度计在260/280 nm测定定总RNA吸光度，计算总RNA浓度等。本研究所提取的总RNA质检结果达到实验要求。

1.3.4 芯片杂交、清洗、染色、扫描 博奥生物公司提供的Affymetrix人U133+2.0芯片，含有54 000多个基因探针，包含了Actin和GAPDH等作为RNA样本的质控对照。取5 μg～10 μg总RNA反转录得到cDNA，体外转录合成生物素标记的cRNA，并将其纯化定量后片段化处理（35～200 bp）。将预杂交液加入到晶芯人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务V2.0芯片中，杂交炉中45 ℃预杂交10 min，取出预杂交液，加入等体积的杂交液及生物素标记cRNA 45 ℃杂交16 h。从杂交炉中取

出芯片，加入洗脱液和染色液各组分在全自动的洗脱染色工作站（fluidics station 400）中完成洗脱和染色的步骤。用扫描仪（gene chip scanner）扫描芯片，获取基因表达的荧光信号强度值，用预先选定的内参照基因信号进行校正。计算两组荧光信号强度的比值。差异基因筛选标准：Fold Change（倍数变化值）≤0.5或≥2并且q-value（变化趋势的信度判断）≤5%。所有基因均进行基因表达的检测。

1.4 数据的提取及分析 使用AGCC软件（Affymetrix GeneChip Command Console Software）将芯片的荧光扫描图像保存成DAT文件并进行分析，用Cluster和MAS软件对数据进行处理。

2 结 果

对5对样本进行检测，共扫描约40 000个基因，对于CRELD1基因，其在两组的基因表达情况近似，Fold Change为1.095，q-value为100%，差异无统计学意义。

3 讨 论

心脏发育是一个极其复杂的过程，其从中胚层细胞分化、线性心管形成至最终四腔心室形成，受多条信号通路严密而精确的调控，涉及多种基因不同时间和不同空间的先后表达与相互作用，也涉及细胞的迁移、分化、增生及精确的相互作用[7-10]。既往对房间隔缺损、VSD等简单型先心病发病机制研究较多[11，12]，对于复杂先心病，像CAVSD研究较少。CAVSD患儿多合并21-三体综合征（唐氏综合征），通常伴有智能发育不全，全身肌张力低，特殊面容，颅骨前后径短，枕骨扁平，囟门大且闭合延迟等心外发育的异常[13，14]，这类患儿给家庭带来了沉重经济负担和压力，因此对CAVSD的研究具有重要意义。

CAVSD也叫完全型心内膜垫缺损，与胚胎发育过程中房室心内膜垫发育障碍有关，其发生机制尚未明了，目前认为有遗传因素参与，迄今已发现2个与CAVSD有关的基因位点：AVSD1和AVSD2，其中AVSD1位于染色体1p31～21，但尚未发现具体的相关基因[3]；AVSD2位于染色体3p25，对应的基因是CRELD1。CRELD1最初是由于在3P综合征有3p25 区带缺失的患者中发现常合并有先心病，而CRELD1基因正处于染色体的这一区带并在胚胎发育的房室心内膜垫中有表达，因此引起了研究者的兴趣。Robinson等[15-19]对CRELD1基因突变进行了相关研究，提示它是一个细胞黏附分子，这种蛋白可能参与细胞与细胞之间的相互作用，参与机体生长发育的过程，也可能直接影响细胞外基质的产生与沉积。目前常见的与心内膜垫发育有关的有BMP/FGF、EGF等信号系统，由于CRELD1分子中包含有EGF样结构，因此考虑它可能还与EGF通路有关[20，21]。

基因芯片技术（gene chip或microarray）又称DNA微阵列，就是以综合、全面、系统的观点来研究生命现象的一种实验方法，可以大规模、高通量地对成千上万个基因同时进行研究分析。它综合了各学科的高新技术，通过将几千个基因特异的探针或cDNA进行检测，能大规模对这些基因进行综合分析和判断[22]。因此，相对于抵制性差减杂交（SSH）和差异技术PCR（DD-PCR）等其他寻找不同组织间差异表达基因的方法，基因芯片技术更能从全局角度了解各种不同组织中总体上基因表达情况和变化规律，为全局理解基因功能和基因之间的相互关系及至发病机制提供了线索。近年来基因芯片技术广泛应用于分析先心病染色体某一部位的基因缺陷的研究中[23]。意大利人Miertus等[24]2001年首次使用基因芯片对心脏畸形进行了分析，德国心脏中心[25]2003年采用广谱人类cDNA微阵列对50例先心病患者的心肌组织样本进行基因表达谱变化的研究，并按样本的疾病类型及样本所在心脏的解剖学部位差异对微阵列基因表达改变进行统计学比对，揭示了发育正常及异常心脏的基因图谱，揭开了先心病发病分子机制的面纱。荷兰Sharma等[26]采用基因芯片技术对法洛氏四联症（TOF）合并右心扩大患者进行基因表达差异研究，认为细胞外基质蛋白（ECM）和血管内皮生长因子（VEGF）表达上调是TOF患者右心肥厚及血管发育不良的关键。利用微阵列技术对先心病相关的基因表达进行研究将为先心病致病基因的筛选提供良好的平台。

本实验所选芯片Affymetrix U133，包含54 000个探针组，可以检测38 500个基因的47 000个转录本，这款芯片是目前发表文献和GEO收录数据数量最多的人表达谱芯片。从实验需求上，能满足大多数人基因表达谱检测。同时Affymetrix表达谱芯片在设计上，一般一个基因设计9～11个探针，在保证总体数量的同时，也保证了每个基因的检测准确度；同时还选用了特意的PM-MM探针设计，进一步保证探针检测的准确度。

本实验共扫描约40 000个基因，对两组间21 785个基因表达进行对比，但对于CRELD1基因，其在两组的基因表达情况近似。对此，本实验小组成员进行了深入分析。首先，对照组样本的选择可能欠妥，由于健康儿童心肌无法获取，有报道选取健康流产胎儿作对照或者以双胞胎作为研究对象，本研究由于实验期限短未能选取正常儿童心肌组织作对照可能影响实验结果。其次，如果能取实验组外周血并与健康儿童外周血做比较结果可能更具说服力，本研究后期实验可以考虑增加这部分内容做进一步验证。第三，样本例数偏少，每组之间可能存在较大差异，影响结果，后期实验可以补充部分病例加大样本量进一步筛选其他突变基因。

了解先心病的发病机制，从受精卵受精之初至心脏发育完全，如何能防止先心病的发生，真正做到一级预防，优生优育，是一条漫长但是非常有意义的路。本次实验虽然未得到阳性结果，但是对于了解先心病基因表达差异，寻求先心病基因芯片筛查与诊断，更好地研究先心病发病机制及为大规模基因筛查提供了有意义的探索。

本实验结果显示CRELD1基因在CAVSD与VSD两组患儿心肌组织中的表达相近似，提示汉族儿童中，CRELD1基因可能与多种先心病相关或者CAVSD可能是一种多基因的遗传性疾病。

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