时间：2022-05-13 07:39:13
[摘要] 目的 研究IL-17及IL-6在大鼠肺纤维化发生过程中的表达，以探讨其可能在大鼠肺纤维化发生发展过程中作用。 方法 取健康雄性Wistar大鼠72只，随机分为正常对照组（N组）、肺纤维化模型组（M组）及地塞米松治疗组（T组）。肺纤维化模型组和地塞米松治疗组向气管内灌注博来霉素（BLM）5 mg/kg，制备肺纤维化模型。正常对照组采用气管内灌注生理盐水替代。地塞米松治疗组于次日腹腔注射地塞米松注射液（1 mg/kg），隔日1次。正常对照组和肺纤维化模型组腹腔注射生理盐水。三组动物于造模后第3、7、14、28天分批处死。留取肺组织，石蜡包埋切片，观察其病理学改变并测定肺组织中羟脯氨酸含量。用双抗夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中IL-17及IL-6的含量。 结果 肺纤维化模型组肺组织病理切片表现为逐渐由肺泡炎至纤维化动态改变过程，肺组织内羟脯氨酸高于正常对照组和地塞米松治疗组。肺纤维化模型组血清IL-17水平、IL-6水平各时间点均明显高于正常对照组及地塞米松治疗组。肺纤维化模型组及地塞米松治疗组血清IL-17及IL-6水平于第7天达到峰值。 结论 IL-17及IL-6在肺纤维化模型组的高表达，提示其可能参与肺纤维化形成过程。
[关键词] IL-17；IL-6；肺纤维化
[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）04（a）-0024-03
Dynamic expression and significance of IL-17 and IL-6 in the process of pulmonary fibrosis in mice
ZHANG Huiqin LIU Xuejun
Department of Geriatrics, the First Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To investigate the change of interleukin-17 (IL-17) and interleukin-6 (IL-6) in the process of rats pulmonary fibrosis, and to observe the effection of this two factors on rats pulmonary fibrosis. Methods 72 healthy male Wistar rats were randomly divided into three groups: normal control group (group N), pulmonary fibrosis model group (group M) and dexamethasone treatment group (group T). Model group and treatment group received intra-tracheal instillation of 5 mg/kg bleomycin (BLM), preparation of pulmonary fibrosis. Normal control group received intra-tracheal instillation of saline instead. The next day treatment group injected dexamethasone (1 mg/kg) by intraperitoneal every other day. The control group and model group were injected with saline. The rats were killed on the 3rd, 7th, 14th and 28th day after modeling. Hold the lung tissue and embed in paraffin to observe the lung tissue pathological sectionl changes and determine the level of hydroxyproline in lung tissue. The levels of IL-17 and IL-6 in surem were measured by double antibody sandwich (ELISA). Results In model group, lung tissue biopsy showed the dynamic process of change from alveolitis to fibrosis gradually, and the level of hydroxyproline in lung tissue was higher than the control group and dexamethasone group. Levels of IL-17 and IL-6 in surem in the model group were significantly higher than the control group and treatment group at all time points. In model group and treatment group, IL-17 and IL-6 had peak on 7th day. Conclusion The high expression of IL-17 and IL-6 in lung fibrosis model group suggests that it may involves in the formation of pulmonary fibrosis.
[Key words] IL-17; IL-6; Pulmonary fibrosis
特发性肺纤维化（IPF）是病因未明的慢性进展性纤维化型间质性肺炎的一种特殊类型，好发于老年人，病变局限于肺部，组织病理学和（或）影像学表现具有普通型间质性肺炎（UIP）的特征[1]。目前对特发性肺纤维化发病机制的认识尚不十分明确。本实验利用博来霉素复制肺纤维化动物模型，通过观察IL-17以及IL-6含量的动态变化，从而进一步探讨IPF的发病机制，为早期诊断提供新的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
清洁级健康雄性Wistar大鼠72只，体重（200±20）g，山西医科大学生理实验室动物房提供；注射用盐酸博来霉素，15 mg/支，日本化药株式会社生产；羟脯氨酸试剂盒、IL-17、IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 分组及模型建立
72只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（N组）、肺纤维化模型组（M组）和地塞米松治疗组（T组），每组各24只，正常对照组气管内注入生理盐水0.5 mL；肺纤维化模型组和地塞米松治疗组向气管内注射5 mg/kg体重博来霉素，地塞米松治疗组灌注后隔日1次腹腔注射地塞米松（1 mg/kg），对照组和模型组注射生理盐水。
1.3 标本处理
各组大鼠于造模后的第3、7、14、28天分别随机抽取6只行腹主动脉放血法将其处死，并收集腹主动脉血1 500 r/min离心10 min，留取血清-20℃保存备用；剖开胸腔，取右肺上中叶-20℃保存，待测羟脯氨酸（HYP）含量；取右肺下叶中性甲醛固定石蜡包埋切片，观察病理学改变。
1.4 检测指标
①组织学观察，取右上叶肺4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，行HE染色。②肺组织羟脯氨酸含量检测，采用碱水解法，严格按照羟脯氨酸测试盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明书检测。③血清中细胞因子水平 IL-17及IL-6用双抗夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测，严格按照试剂盒说明书操作。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组内采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜下肺组织病理学
正常对照组大鼠在各时间点均未出现明显的病理变化。肺组织结构清晰完整，肺泡壁无增厚，肺泡腔内无炎性渗出。肺纤维化模型组大鼠在造模后第3天出现明显的肺泡炎性改变，可见炎症细胞浸润，第7天时其炎症细胞浸润更为明显，成纤维细胞开始增生，肺泡间隔增宽，病灶内肺泡萎缩。第14天肺泡炎症减轻肺泡腔内仍有少量炎性渗出，成纤维细胞大量增生，肺泡间隔明显增宽间，肺泡结构有所破坏。第28天肺组织实变，肺泡炎性渗出减少，纤维化程度明显加重，大量肺泡结构破坏。见图1。地塞米松治疗组也出现从肺泡炎到肺纤维化的变化过程，但变化程度较模型组轻。
A B
A.正常组肺组织HE染色（×400）；B.模型组第28天肺组织HE染色（×400）
图1 肺组织HE病理切片
2.2 大鼠肺组织中羟脯氨酸含量变化
正常对照组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量随时间变化无明显改变。模型组和治疗组大鼠肺组织内羟脯氨酸含量随时间延长逐渐增加。模型组羟脯氨酸含量较对照组明显增加（P ＜ 0.05），治疗组羟脯氨酸含量较对照组明显增加（P ＜ 0.05），较模型组明显减少（P ＜ 0.05）。见表1。
2.3 血清中IL-17及IL-6的含量
模型组大鼠血清中IL-17的含量各时间点较对照组相比显著增高，且在第7天达到高峰（P ＜ 0.05），之后IL-17含量逐渐减少，但第28天仍高于正常（P ＜ 0.05）。治疗组各时间点IL-17含量均低于模型组（P ＜ 0.05），但高于对照组中的含量（P ＜ 0.05），见表2。各组大鼠血清IL-6含量的动态变化与血清IL-17变化规律基本相同，见表3。
表2 大鼠血清IL-17含量（x±s，pg/mL）
注：与N组比较，aP ＜ 0.05；与M组比较，bP ＜ 0.05
表3 大鼠血清IL-6含量（x±s，pg/mL）
注：与N组比较，aP ＜ 0.05；与M组比较，bP ＜ 0.05
3 讨论
肺纤维化是由多种原因引起的弥漫性肺部炎症性疾病，以肺泡结构破坏大量纤维组织增生为基本病理改变。其发病机制至今仍不十分清楚，目前临床上缺乏有效的治疗手段，预后不良。
目前应用博来霉素制备肺纤维化动物模型是目前公认最接近人肺纤维化的实验模型[2]。其中经支气管给药已是国内外公认的成熟方法。故本实验采用气管内注入博来霉素制备大鼠肺纤维化模型。本实验观察，模型组第7天肺泡炎症明显，之后炎症逐渐减轻，肺泡间隔增宽，第28天肺纤维化程度明显加重。由此可证本实验动物模型制备成功。另一方面，Cooper[3]发现，HYP含量能反映胶原代谢情况，测定组织中HYP含量，可以判断纤维化程度。本实验模型组及治疗组大鼠肺组织HYP含量的测定结果随时间逐渐升高，也提示肺纤维化动物模型制备成功。
Veldhoen等[4]发现，小鼠转化生长因子β（TGF-β）和IL-6共同作用诱导T细胞向Th17细胞分化。IL-17的主要生物学功能是促进炎性反应[5]，是Th17细胞分泌的特征性细胞因子，可诱导促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）、趋化因子（如MCP-1）和基质金属蛋白酶的表达，引起炎性细胞的浸润和组织破坏[6]。本研究发现，IL-17在模型组大鼠肺纤维化发生的早期表达升高，并于造模后第7天肺泡炎症最重时达到峰值，进而随着肺纤维化的发展逐渐降低，但仍高于正常对照组。由此可推测IL-17可能参与了肺纤维化发生的全过程。IL-17可诱导上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF以及前列腺素E2（PGE2）[7]。其中IL-6具有广泛的生物学活性，是一种多功能细胞因子。一方面，IL-6能增加胶原蛋白聚集、抑制细胞外基质（ECM）的分解、刺激成纤维细胞的增殖等，在纤维结缔组织形成及平滑肌增生中起重要作用[8]。Denis[9]用抗IL-6抗体明显抑制了大鼠过敏性肺炎的纤维化结果，从而证实IL-6具有致炎、致纤维化的作用。同时，一些肺部炎症也伴有IL-6水平的升高。可见，IL-6与肺部炎症及肺纤维化的形成、发展存在着一定的关联性[10]。本实验结果提示，在肺纤维化的发生过程中，IL-6的表达规律同IL-17基本一致，呈现出先升后降的趋势。
综上所述，IL-17和IL-6有可能从炎症损伤和纤维化两方面参与了肺纤维化的形成。本实验为肺纤维化的诊断及治疗提供了一条新的思路。但由于肺间质性纤维化发病机制复杂，IL-17与IL-6在早期如何参与肺纤维化的发病机制仍需进一步研究。
[参考文献]
[1] Raqhu G，Collard HR，Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement：idiopathic pulmonary fibrosis：evidence-based guidelines for diagnosis and management [J]. Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788-824.
[2] 柳明坤.N-乙酰半胱氨酸对大鼠肺纤维化模型血清MDA的影响[J].中国医学工程，2007，15（3）：225-228.
[3] Cooper AD. Pulmonary fibrosis：pathways are slowly coming into light [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22（5）：520-523.
[4] Veldhoen M，Hocking RJ，Atkins CJ，et al. TGF beta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells [J]. Immunity，2006，24（2）：179-189.
[5] Kolls JK，Linden A. Interleukin-17 family members and inflammation [J]. Immunity，2004，21（4）：467-476.
[6] Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 cells [J]. Annu Rev Immunol，2009，27（3）：485-517.
[7] 邹华，李其皓，董昭兴.Thl7细胞与肺纤维化[J].临床肺科杂志，2011，16（3）：415-417.
[8] Semik Orzech A，Barczyk A，Pierzchala W，et al. The role of interleukin 17 cytokine family in inducing allergic inflammation in the pulmonary tract [J]. Pneumonol Alergol Pol，2006，74（4）：409-413.
[9] Denis M. Interleukin-6 in mouse hypertensitivity pneumonitis：changes in lung free cells following depletion of endogenous IL-6 or direct administeation of IL-6 [J]. J Leukoc Biol，1992，52（2）：197-201.
[10] 刘艳红，范雪云.白细胞介素-6与纤维化疾病[J].中华劳动卫生职业病杂志，2006，24：126-128.
（收稿日期：2012-01-10 本文编辑：张瑜杰）