微山湖河蟹养殖区异养细菌产酶情况对河蟹养殖的影响研究

摘要 为了解微山湖河蟹养殖区水体和底泥中异养细菌胞外产酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、脲酶）情况，对微山湖养殖区微生物进行了初步分离和筛选，并在含有蛋白质、脂肪、淀粉、尿素的固体培养基上培养观察并测量记录菌落和水解圈大小。结果表明：产蛋白水解酶和脂肪水解酶的细菌明显多于产淀粉水解酶和脲酶的细菌数量，同时菌株一般多产蛋白水解酶和脂肪水解酶，少产淀粉水解酶和脲酶，这对河蟹养殖的酶用饲料具有很大的影响。

关键词 胞外酶；水解圈；酶用饲料；河蟹养殖；微山湖

中图分类号 S966.16 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）18-0254-02

近年来，由于人们生活水平的提高，对水产品的需求越来越大，但天然水产品却供不应求，进而产生了许多河蟹养殖区以满足人们对河蟹的需求[1]。目前，饲料工业更多青睐于微生物酶的使用，饲用酶制剂目前被广泛使用，它是通过特定生产工艺加工而成的包含单一酶或混合酶的工业产品。动物直接摄入酶产品具有多项保健效果：补充内源酶（主要是指消化酶类如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等）的不足，激活内源酶的分泌；水解非淀粉多糖（NSP）等抗营养因子，降低消化道内容物粘度；破坏植物细胞壁，使包裹在细胞中的营养物质充分地释放出来，从而增加与消化酶的接触面，提高消化吸收率；提高机体代谢水平，增强免疫力等[2]。近年来的研究表明，酶不仅直接参与营养物质消化和吸收，也影响其代谢和参与有关激素的调节作用；改变消化部位，使某些物质的消化场所由盲肠转移到小肠，减少后肠微生物发酵，提高其消化率[3]。此外，外源酶还有助于改善消化道内环境，如平衡内源酶的分泌，减少肠黏膜细胞的脱落；改变肠壁结构，提高养分吸收能力；减少细菌性疾病的发生等[4]。酶用饲料不仅能消除饲料抗营养因子的有害作用，促进养分的消化和吸收，提高畜禽的生长速率、饲料转化效率和增进畜禽健康，而且能减少养殖业排污中氮、磷的排放，保护生态环境。应用饲料酶制剂是现代化养殖业中经济与生态效益兼顾的重要科学技术措施[5]。

目前，饲用酶制剂有单一酶制剂和复合酶制剂，而且大多是诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量[6]。菌种不同，生产酶制剂所需工艺条件也不同，其最佳工艺参数必须通过试验来确定[7]。只有为培养物提供一个最适的环境，菌体的代谢活动才能得到最充分的表达，酶产量才能提高。提高微生物酶制剂的产量、活性和稳定性，增强产品的市场竞争力是很重要的发展方向。

细菌胞外酶是指那些在细胞内合成后穿过细胞质膜的酶，它们有些镶嵌在质膜上，有些存在于周质空间，有些则完全脱离其生产者，扩散到环境中[8]。特别是异养细菌是水环境中胞外酶的主要生产者。胞外酶是水域生态中有机物的降解不可缺少的物质，同样也有利于水产养殖动物的生长。田 黎等[9]研究了芽孢杆菌产生的胞外酶类和多糖，发现其对水生生物具有促进生产和激发产生免疫病害的功能。微生物最主要的作用是对水体水质的改善，它通过一系列物理和化学作用起到改善水质的作用。特别对于高密度养殖的水体，由于养殖密度大、养殖面积有限，所以水体的自净能力非常有限，到了养殖的中后期，常常会因为水质的变坏导致疾病的发生，所以在高密度养殖水体中要定期加入有益微生物来改善水质，减少疾病的发生。如果有益微生物在水体中达到一定的数量，就会形成特定的种群，这样在生存竞争中，有益微生物就会抑制有害微生物的生长，在很大程度上提高水体的质量，使水体保持一个很好的稳定状态。这样对水生动物也是非常有利的，使它们生活在稳定的水环境中，对它们的生长发育非常有利[9]。

河蟹养殖区中主要产蛋白水解酶和脂肪水解酶[10]，通过试验研究河蟹养殖环境中的主要菌体和主要胞外酶，为饲用酶制剂的加工和选择提供借鉴和参考，以发挥最大的经济和社会效益。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源。从济宁微山湖河蟹养殖区水体中采集水样并制成菌悬液，进一步梯度稀释，基本培养基过夜培养，挑取单菌落，经过多次纯化培养，得到25株菌。

1.1.2 试剂及仪器。琼脂，酵母粉，中性红，酪蛋白，尿素水溶液，豆油，可溶性淀粉，培养皿，三角瓶，高压灭菌锅，显微镜，直尺等。

1.1.3 培养基[6]。①LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂16.0 g（1.6%），蒸馏水1 000 mL，pH值约7.0。②产蛋白酶菌株鉴定的培养基配方：LB培养基+酪蛋白，含量1.0%。③产淀粉酶菌株的鉴定培养基：可溶性淀粉1.0 g，蛋白胨0.5 g，酵母1.0 g，琼脂1.5 g，蒸馏水100 mL，pH值约7.2。④产脲酶菌株的鉴定培养基：LB培养基+酚红0.04 g（或0.2%酚红水溶液20 mL），灭菌后冷却至50～55 ℃，加入20%尿素水溶液10 mL。⑤产脂肪酶菌株鉴定培养基（300 mL）：LB培养基+中性红0.2 mL，豆油2 g，pH值为7.2左右。

1.2 试验方法[11]

1.2.1 样品采集。从济宁微山湖河蟹养殖区水体中直接用灭菌三角瓶从养殖区采集水样。

1.2.2 样品处理。将采集到的水样制成菌悬液，进一步稀释1 000倍，按10倍稀释法连续稀释到10-8，并分别取0.1 mL涂布于制好的固体分离平板上，每个稀释度做3个平行样，置于28 ℃条件下恒温培养。

1.2.3 菌种纯化。从培养好的平板中挑取单菌落，进一步在分离培养基平板上划线分离纯化，28 ℃恒温培养48 h。

1.2.4 菌种鉴定。菌株纯化后，根据菌株培养特征、细胞形态、革兰氏染色等方法测定菌株的生理生化反应，根据结果进行鉴定。从河蟹养殖区分离得到25株菌，将其分别接种在各鉴定培养基上（酪蛋白培养基、淀粉培养基、脂肪培养基、尿素培养基），观察并记录哪种菌株主要产哪种水解酶，并以水解圈直径与菌落直径比（D/d）表示产酶能力的大小，同时记录一种菌株产多种水解酶的情况，以期培育特殊菌种和高产菌种。

2 结果与分析

2.1 产淀粉水解酶菌株的检测

在培养过程中，若菌株具有分泌淀粉水解酶的能力，产生的淀粉酶就会分解培养基中的淀粉，然后在培养基中加入碘液，若菌落周围产生透明的水解圈，说明该菌株能产淀粉水解酶。图1为淀粉培养基，此处为14号菌株所产生的水解圈，即证明了14号菌能够产生淀粉水解酶。

2.2 产脂肪酶菌株的检测

该试验中，细菌分泌的胞外脂肪酶扩散出来，催化培养基中豆油水解成脂肪酸，在中性红指示剂的作用下，形成红色的菌落圈。图2为脂肪培养基，此处为1号菌株所产生的水解圈，证明了1号菌株能够产生脂肪水解酶。图3为脂肪培养基，此处为9、10、11、12号菌株产生的水解圈，证明此4株菌能够产生脂肪水解酶。

2.3 产酪蛋白酶菌株的检测

基础培养基为LB培养基，底物为酪蛋白，将菌株点接到酪蛋白酶检测平板上，培养后若菌落周围出现透明水解圈，则说明该菌株能产酪蛋白酶。图4为酪蛋白培养基，此处为2号菌株产生的水解圈，证明2号菌株能够产生酪蛋白水解酶。图5为3、7、23号菌株产生的水解圈。

2.4 产脲酶菌株的测定

以加入酚红的LB培养基为基础培养基，以尿素为底物，接种培养后，若菌落周围出现透明圈则说明该菌株可产脲酶。

2.5 菌株产酶能力测定统计结果

由表1可知，在河蟹养殖水域，产蛋白水解酶和脂肪水解酶的细菌明显多于产淀粉水解酶和脲酶的细菌，产淀粉水解酶和脲酶的细菌数量相差不大。这可能与河蟹饲料中所含的蛋白质、氨基酸、脂肪、粗纤维、矿物质与维生素有关，可以根据细菌的产酶情况研究选择合适安全的酶饲料，以更有利于河蟹的生长繁殖。

由表2可知，通过水解圈与菌落直径的比值，河蟹养殖环境中，产淀粉水解酶和脲酶水解酶的菌株很少并且D/d值很小，即该菌株产酶活性不高或基本没有。相反，产蛋白水解酶和脂肪水解酶的菌株多而且D/d值大，即该菌株产酶活性大。而且9、10、11号等菌株可以产酪蛋白水解酶和脂肪水解酶，根据以上数据，可以有目的地培养一些产酶活性高的菌株（比如2、10、11、12号菌株）和一些产多种酶的菌株（例如9、10、11号比较明显的菌株），以备酶用饲料及酶制剂的进一步研究。

3 结论与讨论

在LB 培养基基础上增加酪蛋白、淀粉、脂肪或尿素制成的培养基，当培养基上产生水解圈后，则说明该种细菌能够产生分解酪蛋白等物质的水解酶。通过产生水解圈的数量可以比较细菌产生分解该种物质的细菌数量，通过测量水解圈与菌落直径的比值可以得知该菌株的产酶能力[12]。结果表明：产蛋白水解酶和脂肪水解酶的细菌明显多于产淀粉水解酶和脲酶的细菌数量，同时菌株一般多产蛋白水解酶和脂肪水解酶，少产淀粉水解酶和脲酶，这对河蟹养殖的酶用饲料具有很大的影响。

通过研究河蟹养殖水域中的菌体及产酶情况，可以选择合适的酶用饲料或酶制剂，帮助河蟹更好的生长繁殖。再者，根据菌株产酶情况可以进一步培育高产菌株，研究其产酶的最佳工艺条件，为河蟹的生长和生态环境的保护提供借鉴和帮助，创造更大的经济和社会效益。

4 参考文献

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