类风湿性关节炎患者外周血中性粒细胞MMP―7、EMMPRIN表达及意义

[摘要] 目的 观察基质金属蛋白酶7（MMP-7）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）蛋白及mRNA在类风湿关节炎（RA）患者外周血中性粒细胞中的表达，探讨其与RA相关性及意义。 方法 采集2014年1月～2015年5月本溪市中心医院RA患者（RA组）及健康体检者（NC组）外周血中性粒细胞，采用Western blot及qRT-PCR分别检测MMP-7及EMMPRIN在蛋白及mRNA水平表达，采用酶联免疫法检测血清炎性因子表达，并探讨其意义。 结果 RA组中MMP-7及EMMPRIN蛋白表达明显高于NC组（t=7.752，6.627，P

[关键词] 基质金属蛋白酶7；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；类风湿关节炎

[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）04（c）-0046-03

Expression and meaning of MMP-7，EMMPRIN protein and mRNA in peripheral polymorphonuclear leukocytes of rheumatoid arthritis patients

LI Wei1 WU Bao-ping2

1.Department of Emergency，Benxi Central Hospital in Liaoning Province，Benxi 117000，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Coal General Hospital，Beijing 100028，China

[Abstract] Objective To observe the expression of MMP-7，EMMPRIN protein and mRNA in peripheral polymorphonuclear leukocytes of RA patients and to explore the relationship and meaning with rheumatoid arthritis. Methods The peripheral blood neutrophil was collected from RA patients（group RA） and healthy subjects（group NC） from January 2014 to May 2015 in Benxi Central Hospital.Western blot and qRT-PCR were respectively used to tested the expression level of MMP-7，EMMPRIN protein and mRNA.Enzyme linked immunosorbent assay was used to tested the expression of serum inflammatory cytokines and the meaning was explored. Results The expression of MMP-7 and EMMPRIN protein in group RA was obvious higher than that of group NC respectively（t=7.752，6.627，P

[Key words] MMP-7；EMMPRIN；Rheumatoid arthritis

类风湿性关节炎（RA）是一种免疫性疾病，病情迁延不愈，具有较高的致残率[1]，可导致关节功能受损，降低生活质量[2]。在患者外周血中，多种细胞因子参与RA的发生及发展过程，并诱发患者发热及关节红肿等症状[3]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）是一种跨膜蛋白，可诱导基质金属蛋白酶7（MMP-7）在中性粒细胞、单核细胞等向外周血释放，从而调节外周血中多种炎性因子水平，导致患者产生全身及局部症状[4]。本研究通过检测两者在RA患者中表达，旨在观察其与RA的相关性，探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月～2015年5月本溪市中心医院以美国风湿病学会2010年修订的类风湿诊断标准诊断的RA患者27例为研究对象（RA组），体检中心27例健康体检者为对照组（NC组）。其中男29例，女25例，年龄（55.64±23.08）岁，两组在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，无伦理学争议。所有纳入研究患者无心、肺、肝脏、肾脏等重要器官疾病；无其他炎性关节病或伴有其他结缔组织病；无细菌及病毒感染；无肿瘤及血液病；未接受过抗风湿治疗。

1.2 实验材料

粒细胞分离提取试剂盒及Hanks液购自天津TBD公司；兔抗人MMP-7单克隆抗体、兔抗人EMMPRIN单克隆抗体购自美国Sigma公司；miRNA提取分离试剂盒、TRIzol及qPCR试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；引物由大连宝生生物技术有限公司设计合成。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血中性粒细胞的分离 取RA组及NC组患者外周抗凝静脉血各10 ml，Hanks液等倍稀释。按粒细胞分离提取试剂盒说明书进行中性粒细胞的分离及提取，调整细胞数为1×107进行实验。

1.3.2 Western blot 按说明书对中性粒细胞全蛋白进行提取，BCA试剂盒蛋白浓度定量，每条泳道上样量20 μg，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳转至PVDF膜，加入抗体，ECL发光，凝胶显像仪显像，分析灰度值。

1.3.3 qRT-PCR法 按说明书分离纯化中性粒细胞RNA，浓度稀释为1.0 g/L，按反转录-扩增试剂盒说明书进行反转录扩增，反应结束分析溶解曲线。

1.3.4 血清炎性相关因子浓度测定 依照酶联免疫法试剂盒说明书测定所有患者静脉血样血清中CRP、RF、PGE2、IL-8的浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Spearman分析法。以P

2 结果

2.1 EMMPRIN、MMP-7在蛋白及mRNA中表达水平的比较

RA组中MMP-7蛋白表达明显高于NC组（t=7.752，P

表1 EMMPRIN、MMP-7在蛋白及mRNA中表达水平的比较（x±s）

2.2 RA患者炎性相关因子与MMP-7及EMMPRIN蛋白表达水平的相关性分析

外周血中性粒细胞MMP-7及EMMPRIN蛋白表达与外周血CRP、RF、PGE2、IL-8水平呈正相关（P

3 讨论

RA以滑膜增殖及骨质破坏为主要特征，常伴有全身症状，包括发热、无力、神经受累、心脏受累及肾脏受累等全身症状[5-6]。大量的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在外周血及关节腔内的释放是RA发生、发展的主要原因之一[7]。MMPs代谢产物水平是RA病情活动度重要指标之一[8]。EMMPRIN是重要的MMPs上游调控因子之一，在转录水平调控MMPs的表达。赵元等[9]认为，EMMPRIN表达对MMP分泌具有刺激作用。另有研究[10-11]显示，中性粒细胞通过EMMPRIN促进RA患者滑膜MMPs表达和活化，增强成纤维细胞侵袭力，EMMPRIN拮抗剂可抑制这种促进作用，为RA关节骨和软骨损伤机制及治疗提供了重要的线索。RA患者滑膜组织中EMMPRIN mRNA表达明显高于正常滑膜组织，通过上调MMPs促进关节软骨破坏[12]。

本研究结果显示，在类风湿关节炎外周血中性粒细胞中MMP-7及EMMPRIN蛋白及mRNA表达水平明显高于NC组，说明MMP-7及EMMPRIN表达与RA具有相关性，EMMPRIN是免疫球蛋白超家族成员之一，是潜在的细胞表面粘附因子，对MMP-7释放具有调控作用，参与组织降解及重建，EMMPRIN对MMP-7的调控作用可能发生在转录水平[13]。有研究显示，EMMPRIN通过激活中性粒细胞TLR4受体促进MMP-7表达。本研究结果显示，外周血中性粒细胞MMP-7及EMMPRIN蛋白表达与血清炎性反应因子CRP、RF、PGE2、IL-8水平呈正相关，血清中CRP、RF、PGE2、IL-8是反映RA炎症程度及病情活动情况的重要指标[14]，提示EMMPRIN及MMP-7参与RA疾病活动过程，可能作为RA疾病严重程度及预后的预测指标。有研究[15]显示，RA患者外周血单个核细胞EMMPRIN蛋白及mRNA高于健康对照组，并与炎性因子及关节放射线分期具有正相关性。

本研究认为，MMP-7及EMMPRIN与RA发展具有正相关性。阻断EMMPRIN在转录水平的表达是否可以抑制RA中MMP-7释放，从而减少炎性因子表达，抑制全身反应，减轻骨和软骨组织破坏，改善患者生活质量，选择性抑制EMMPRIN的生物活性，可能是RA治疗的新途径，是进一步的研究目标。

[参考文献]

[1] Hallert E，Husberg M，Kalkan A，et al.Rheumatoid arthritis is still expensive in the new decade：a comparison between two early RA cohorts，diagnosed 1996-98 and 2006-09[J].Scand J Rheumatol，2016，26（8）：1-8.

[2] Saad MN，Mabrouk MS，Eldeib AM，et al.Identification of rheumatoid arthritis biomarkers based on single nucleotide polymorphisms and haplotype blocks：a systematic review and meta-analysis[J].J Adv Res，2016，7（1）：1-16.

[3] Prescott J，Karlson EW，Orr EH，et al.A prospective study investigating prediagnostic leukocyte telomere length and risk of developing rheumatoid arthritis in women[J].J Rheumatol，2016，43（2）：282-288.

[4] Kizaki K，Yoshizumi Y，Takahashi T，et al.Elevated oxidative stress monitored via the albumin-thiol redox state is correlated with matrix metalloproteinase-3 elevation in patients with rheumatoid arthritis[J].Clin Lab，2015，61（1-2）：175-178.

[5] Medeiros MM，de Oliveira BM，de Cerqueira JV，et al.Correlation of rheumatoid arthritis activity indexes（Disease activity score 28 measured with ESR and CRP，simplified disease activity index and clinical disease activity index）and agreement of disease activity states with various cut-off points in a Northeastern Brazilian population[J].Rev Bras Reumatol，2015，55（6）：477-484.

[6] Ambrosino P，Lupoli R，Di Minno A，et al.Subclinical athe-rosclerosis in patients with rheumatoid arthritis.A meta-analysis of literature studies[J].Thromb Haemost，2015，113（5）：916-930.

[7] Wang CH，Dai JY，Wang L，et al.Expression of CD147（EMMPRIN） on neutrophils in rheumatoid arthritis enhances chemotaxis，matrix metalloproteinase production and invasiveness of synoviocytes[J].J Cell Mol Med，2011，15（4）：850-860.

[8] Huang J，Xie B，Li Q，et al.Infliximab reduces CD147，MMP-3，and MMP-9 expression in peripheral blood monocytes in patients with active rheumatoid arthritis[J].Eur J Pharmacol，2013，698（1-3）：429-434.

[9] 赵元，周新民，廖晓波，等.风湿性心脏病致心力衰竭患者心肌组织中基质金属蛋白酶-1，9及其相关因子TIMP-4和EMMPRIN的表达及意义[J].中南大学学报（医学版），2009，34（8）：790-795.

[10] 梁晓辉，朱平，杨勇，等.中性粒细胞增强类风湿关节炎滑膜细胞产生基质金属蛋白酶及其细胞侵袭力[J].细胞与分子免疫学杂志，2007，23（9）：827-830.

[11] 吴振彪，卢宁，史战国，等.EMMPRIN/CD147对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞合成基质金属蛋白酶的刺激作用[J].中华风湿病学杂志，2005，9（9）： 537-540.

[12] 金群华，吕厚山，陈占昆，等.类风湿关节炎滑膜组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的研究[J].中华风湿病学杂志，2004，8（5）：281-283.

[13] Rong MY，Wang CH，Wu ZB，et al.Platelets induce a proinflammatory phenotype in monocytes via the CD147 pathway in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2014，16（6）：478.

[14] Redman RS，Kerr GS，Payne JB，et al.Salivary and serum procalcitonin and C-reactive protein as biomarkers of periodontitis in United States veterans with osteoarthritis or rheumatoid arthritis[J].Biotech Histochem，2016，91（2）：77-85.

[15] 郭惠芳，孙熠峰，刘淑霞，等.HMGB1在类风湿关节炎疾病活动中的作用及其与EMMPRIN/CD147表达的相关性研究[J].中国免疫学杂志，2009，25（7）：662-665.

（收稿日期：2016-02-08 本文编辑：王红双）