某某地区1250例HPLC筛查α地贫结果分析

【摘要】目的：探讨高效液相色谱法(HPLC)诊断某某地区地中海贫血的临床价值。方法：对某某地区1250例孕妇应用HPLC筛查α地贫。结果：1250例孕妇开始检测出35例疑似地贫，全血标本经HPLC法测定HbA异常20例，其中16例疑似α-地贫，4例疑似β地贫，正常5例。结论：HPLC筛查对诊断α地贫检出率差异具有显著性，对诊断α地贫具有很高的符合率，但是也需要结合其他方法进行共同诊断。

【关键词】α地贫；高效液相色谱法；某某地区

地中海贫血(地贫)是由于珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白链合成受到部分或完全抑制而引起的一组遗传性溶血性贫血。是我国南方地区最常见的遗传性血液病。目前地贫尚无有效的治疗方法，而地贫直接影响我国人口素质，是地贫高发区亟待解决的公众健康问题，是摆在妇幼工作人员面前的一项艰巨任务。在发生分子生物学机制上，地中海贫血是由于珠蛋白链合成减少或缺乏所致的遗传性溶血性贫血。我们应用HPLC技术并结合PCR扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳对地贫进行基因检测。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1病例来源本文所选择的病例为2006年4月到2010年6月我院围产期筛查的孕妇，共检测了1250例，年龄19-36岁，平均年龄28.5岁。受检者均采用血液自动分析仪检测MCV、红细胞脆性检测筛查地贫，并对其中35例疑似病人采用HPLC技术进行地贫基因检测确诊。疑似病人经血液学分析、Hb电泳、红细胞脆性及基因检测，检出孕妇为HbG复合，缺失型仅地中海贫血；孕妇丈夫检出东南亚缺失型仅地中海贫血。孕妇主诉有不良流产史，体查无临床症状。

1.2实验方法将野生型和突变型引物分两管，通过六重PCR反应，采用HPLC同时检测六个位点：配好各检测液体，并连接好各管道和液体；打开恒压装置、电源、电脑、紫外检测器、温度显示器、泵等；程序初始化，连接电脑控制和紫外检测器等装置；打开泵，排空管道中的气体，同时冲洗针，调节温度至50度；设定A、B液体为50%，平衡检测柱20min左右；设定检测程序、检测样品编号等；向96孔板内依次加样，检测；检测完毕，调节D液体至100%，冲洗检测柱。

1.3基因组的检测以上是对突变纯合子质粒样本的检测，为了验证同样的反应和检测手段是否能用于基因组样本，我们采用与质粒样本相同的条件检测基因组样本。原始数据自动储存并同时打印色谱报告。实验操作完全按照仪器使用说明。

2结果

35例全血标本经HPLC法测定HbA异常20例，其中16例HbA2≤ 2.5 ，疑似α-地贫。4例HbA2≥3.5，疑似β地贫。正常5例。在具体基因检测中，将多个位点野生型和突变型引物同时检测。由于同一位点的野生型和突变型长度差异为10bp，所以通过HPLC，我们可辨别部分位点，如CD28、CD17突变位点扩增产物出峰位置较正常组前移(短10bp)。

3 讨论

地贫是我国南方地区最常见的遗传性血液病，20世纪80年代的普查统计广西地贫发病近15%；曾溢滔报道地贫广东发病率为7.3%；陶小君等报道番禺区育龄妇女地中海贫血阳性率为12.O%，基因检测结果为阳性率为9.0%。

已发现α-地贫基因突变类型至少有81种，本文研究的为我国常见的18种突变，血常规参数常作为地贫的首要筛查指标。但是MCV和MCH降低与贫血严重程度不成比例。所测的海南地区地贫常见基因类型与广东、广西报道相似，与江西最常见的地贫基因类型略有不同。在检测中，非基因检测技术对设备要求较低，且费用低廉，但特异性不高。高效变性液相色谱是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。

本实验基于片段长度通过HPLC检测了地中海贫血常见的六个突变位点：CD28、CD17、CD26、CD41、CD71、ⅣS654。由于地中海贫血常见突变位点距离较近，CD17和CD26两位点距离很近，相距约20bp碱基，通过普通的凝胶电泳已无法检测，通过HPLC可将以上位点明显分开。因此我们采用多重引物延伸反应和HPLC检测手段相结合，采用HPLC检测分别检测野生型和突变型多重引物延伸反应产物，对距离较近的六个突变位点同时进行检测。通过采用正常质粒或正常基因组样本作为对照，我们可清晰分辨各位点出峰位置。在野生型引物检测曲线上，正常位点均出现了检测波峰，在突变型检测曲线上，突变位点均出现了检测波峰，检测样本和对照各波峰位置相对应，未出现明显的偏差，因此通过这种检测方法体系，我们可对样本的基因型进行检测，包括野生型纯合子、突变型纯合子以及杂合子三种基因型的检测。本实验中CD28和CDl7位点的野生型和突变引物反应产物在270bp长度范围内相差10bp，通过HPLC能区分，但是其他四个位点的反应产物长度在270-400bp范围内相差10bp，HPLC已不能区分，而且随着片段长度的增加，HPLC区分能力会逐渐下降，这可能与基因片段长度增加造成样品滞留，使检测峰增宽、区分能力下降有关。

总之，地贫是一种遗传病，而且目前的治疗还存在较大困难，但是只要我们开展人群普查和HPLC筛查，最好婚前和孕期指导，是完全可以预防的。

参考文献

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