非放射性标记免疫分析技术浅析

摘 要:近年来很多人试图用其他标记技术替代放射性标记,主要目的在于提高灵敏度,以满足某些含量特别低的对象,同时减少放射性废物,在这样的背景之下,非放射性标记免疫分析逐渐成为学界关注和研究的一个热点,亦将对此进行分析和讨论。

关键词:非放射性标记免疫;ELISA;CLIA;TrFIA

RIA和IRMA在免疫分析技术中已经比较成熟,应用方便,可测定的品种也较多。近年来很多人试图用其他标记技术替代放射性标记,主要目的在于提高灵敏度,以满足某些含量特别低的对象,同时减少放射性废物,在这样的背景之下,非放射性标记免疫分析逐渐成为学界关注和研究的一个热点。

从免疫分析的角度而言,非放射性免疫分析技术与传统分析技术原理是相同的,只是最后的信号不是放射线而是其他物理形式,探测仪器也有所不同。常见的非放射性免疫分析技术主要有以下3类:

1酶标记免疫分析技术

用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子,进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术,统称为酶标记免疫分析技术(ELA),其中应用最广的且被认为最有前途的是酶联免疫吸附分析法(ELISA),其基本原理是在抗体分子上连接酶分子,代替放射性标记的抗体,进行和IRMA相似的夹心法免疫反应,反应结束后,将结合的复合物和游离抗体分开,取结合部分,利用酶的催化活性,由结合部分上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用分光光度计测定,颜色的深浅和酶的量呈正比,而酶的量又和结合物的量成正比,由此定出复合物的量。最常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP),其常用的底物是四甲基联苯胺(TMB),反应后显黄色。

ELISA的主要优点是只需普通的分光光度计便可工作,虽然分光光度计的灵敏度不如放射性测量仪器,但是酶反应有放大作用,少量酶分子可以形成大量有色产物,可以将灵敏度补偿过来。值得一提的是,酶标记免疫分析技术一旦将底物显色后即难于复原,显色反应往往需要在一定时间内读书,因此是一次性的,无法重复测量,这是ELISA的一个缺陷。

2化学发光免疫分析技术

(1)化学发光免疫分析:化学发光免疫分析技术(CLIA)的基本原理是将标记物改为能产生化学发光的化合物,以代替放射性标记。最常用的发光化合物是异苯巴比妥和甲基氮蒽,它们在碱性条件下遇到过氧化物便发生单光子发射,光子的数量和异鲁米那和甲基氮蒽成正比,而异鲁米那或甲基氮蒽的量是结合在抗原抗体复合物上的,由此反映复合物的量,这种方法的主要缺点是发光时间集中在加入过氧化物或碱的时间内,必须严格掌握测量的时间,甲基氮蒽的反应过程如图1所示:

(2)化学发光酶免疫分析技术:化学发光酶免疫分析技术(CLEIA)的标记物是碱性磷酸酶标记的抗体。经过夹心法免疫反应(和IRMA)相似,复合物带有酶标记,加入底物,酶促反应使底物断裂,产生化学发光。底物是金刚烷,在碱性磷酸酶作用下先脱去磷酸根形成中间体,中间体自行断裂,同时发射光子。由于酶反应要持续一段时间发射光子过程明显比上述单纯化学发光长,而且在一段时间内维持稳定,所以本法的可靠性较高。金刚烷的发光机制如图2所示。

(3)时间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术(TrFIA)的标记物由镧系元素通过一定的连接剂与抗体蛋白相连而组成。待测物通过免疫反应形成的复合物上就带有镧系元素,最常用的是铕。由经紫外线激发后会发出荧光,这种激发完全是一个物理现象,所以可以反复进行,大大增强信号强度。所谓时间分辨,是因为镧系元素受激活后产生的荧光寿命长,而一般干扰荧光的寿命短几百倍,因此设计的专用仪器把测量时间定在每次激发后的数百μs之后才开始,此时干扰荧光已衰减到很低的水平。待镧系元素的荧光也衰减到很低水平,就停止记录,然后开始下一次紫外线激发,见图3。

测量时间的分配示意图

非放射性标记免疫分析与传统的放射性免疫分级相比,操作更简单,技术要求更低,因此适用范围得到了很大的提升,同时不产生放射性垃圾,这对医学研究中的环保显得非常重要。相信随着医学研究水平的不断进步,非放射性标记免疫分析技术也一定可以实现更大的突破。

参考文献

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