HPLC法同时测定生发片中二苯乙烯苷和特女贞苷的含量

【摘 要】 目的：建立HPLC同时测定生发片中二苯乙烯苷和特女贞苷含量的方法。方法：样品用70%甲醇超声提取。色谱柱：Inertsil ODS-3-C18（5μm，250mm×4.6mm）；流动相：乙腈-水（17∶83）；检测波长：224nm；流速：1.0ml/min；进样量：10ml。结果：二苯乙烯苷在0.01618～0.2426mg范围内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率为100.1%（n=6），RSD=1.84%；特女贞苷在0.0816～1.224mg范围内线性关系良好（r=0.9998），平均加样回收率为100.6%（n=6），RSD=1.38%。结论：本方法简单、准确，可作为生发片的质量控制方法。

【关键词】 生发片；二苯乙烯苷；特女贞苷；高效液相色谱法；含量测定

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0011-03

Abstract：Objective To determine the content of 2，3，5，4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-gluco side and Specnuezhenide in Shengfa Tablets by HPLC. Methods Samples were extracted by 70%methanol ultrasonic，then analyzed on the Inertsil ODS-3-C18（5μm，250mm×4.6mm）with the mobile phase acetonitrile-water（17∶83）. Detect wavelength was 224nm，f-low rate was 1.0ml/minand injection volume was 10ml.Results The linear range of 2，3，5，4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside was 0.01618～0.2426mg（r=0.9999），and the average recovery was 100.1% with RSD of 1.84%（n=6）. The linear range of Specnuezhenide was 0.0816～1.224mg（r=0.9998），and the average recovery was 100.6% with RSD of 1.38%（n=6）.Conclusion The method is simple and accurate for the quality control of Shengfa Tablets.

Keywords：Shengfa Tablets；2，3，5，4′-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside；Specnuezhenide；HPLC；determination of content

生发片收载于《中药成方制剂》第十七册[1]，由何首乌、女贞子、山药、黑枣、黑豆、茯苓、牡丹皮、地黄、墨旱莲、泽泻、桑葚、麦冬12味中药组成，具有滋补肝肾、益气养血、生发乌发之功效，主要用于肝肾不足、气血亏虚所致的头发早白、脱落、斑秃、全秃和脂溢性脱发。二苯乙烯苷是何首乌特有的生物活性成分[2]，研究表明二苯乙烯苷能够诱导小鼠 B16 细胞色素沉着[3]，并且通过诱导休眠毛囊进入生长期促进头发的生长[4]。特女贞苷是女贞子中重要的水溶性活性成分[5]，女贞子水煎剂能增强小鼠毛囊肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA的表达，对体外培养的小鼠触须毛囊有明显的促生长作用[6-7]。生发片原标准中只有还原糖的鉴别，无含量测定项，为了更好地控制生发片的质量，研究采用HPLC同时测定了本品中二苯乙烯甘和特女贞苷含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（VWD检测器，Agilent1200化学工作站）；赛多利斯BSA224S-CW型电子天平（精确度为十万分之一）；SB-4200 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.2 材料 特女贞苷对照品（批号：111926-201404）、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号：110844-201512）购自中国食品药品检定研究院；生发片（批号：1512079 T家）；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3-C18（5μm，250mm×4.6mm）；流动相：乙腈-水（17∶83）；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：224nm；进样量：10ml。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取特女贞苷和二苯乙烯苷对照品适量，置25ml容量瓶中，加70%甲醇溶解定容到刻度，摇匀，配成质量浓度分别为1.02和0.202mg/ml的特女贞苷和二苯乙烯苷混合对照品储备液。精密吸取上述储备液1.0ml置10ml容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得0.102mg/ml的特女贞苷和0.0202mg/ml的二苯乙烯苷混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50ml 70%甲醇，称定重量，超声（功率 400W，频率 40kHz）30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按照生发片的制备工艺，分别制备不含何首乌和女贞子的阴性样品，参照供试品溶液的制备方法同法操作，制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照“2.1” 项下的色谱条件进行试验。记录色谱图，理论塔板数按二苯乙烯苷峰计不低于6000，按特女贞苷峰计算不低于7000；二苯乙烯苷和特女贞苷与其他组分的分离度均>1.5；供试品溶液中二苯乙烯苷和特女贞苷的色谱峰与对照品溶液一致，阴性对照无干扰。结果见图1。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下的对照品储备液0.2、0.3、0.5、1、2、3ml，置25ml容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，以混合对照品的进样量（mg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得到二苯乙烯苷的回归方程为Y=3787.6X+1.4319，r=0.9999；特女贞苷的回归方程为Y=985.26X+5.5701，r=0.9998。线性范围分别为0.01618～0.2426mg、0.0816～1.224mg，结果表明，各成分在各自浓度范围内具有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1” 项下的对照品溶液， 按“2.1”项下的色谱条件分别连续进样6次，测得二苯乙烯苷峰面积的RSD=0.33%、特女贞苷峰面积的RSD=0.12%，结果表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取生发片（批号：1512079），按照“2.2.2”项下的方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别测定含量。得二苯乙烯苷和特女贞苷的平均含量分别为0.1643mg/g、1.5631mg/g，RSD分别为0.71%、1.2%，结果表明重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取生发片（批号：1512079），按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别在制备后的第0、2、4、6、8、12h进样，记录二苯乙烯苷和特女贞苷的峰面积，计算RSD分别0.34%和0.92%，结果表明，供试品溶液在12h内稳定性良好，能够满足试验要求。

2.3.6 加样回收试验 精密称定已知含量的生发片（批号：1512079，二苯乙烯苷含量约为0.3286mg、特女贞苷含量约为3.1262mg）6份，每份约2.0g，精密加入混合对照品溶液（含二苯乙烯苷0.06604mg/ml、特女贞苷0.6252mg/ml）5ml，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别进行含量测定，计算回收率。结果二苯乙烯苷的平均回收率为100.1%，RSD=1.84%；特女贞苷的平均回收率为100.6%，RSD=1.38%。

2.4 样品测定 取5批供试品，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项下的色谱条件下进行进样分析，测定二苯乙烯苷和特女贞苷的含量，结果见表1。

3 讨论

3.1 流动相的选择 分别对甲醇-水、乙腈-水和乙腈-酸三个流动相系统进行了考察，结果乙腈-水系统的分离度和峰形均比甲醇-水系统好，乙腈-酸系统和乙腈-水系统差别不大，考虑到色谱柱的使用寿命和操作问题，选择乙腈-水做为流动相。

3.2 检测波长的选择 分别用70%甲醇配制二苯乙烯苷和特女贞苷的对照品溶液，在波长200～400nm范围内扫描，图谱显示在224nm处特女贞苷有最大吸收，二苯乙烯苷在224nm和320nm处均与较强吸收，因此，选择224nm作为检测波长。见图2。

3.3 对提取溶剂的考察 比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇在相同提取条件下对二苯乙烯苷和特女贞苷的提取率，结果表明，70%甲醇和甲醇的提取率均较高，考虑到生产成本，确定70%甲醇为提取溶剂。

3.4 提取方法和提取时间的考察 比较了超声和加热回流两种提取方法对二苯乙烯苷和特女贞苷提取率的影响，结果表明，两种方法的提取率接近，由于超声提取的操作更加简单，所以选择超声提取。分别对15、30、45、60min超声时间做了对比，结果显示30min即可将上述两种成分提取完全，所以将超声时间定为30min。

综上所述，本方法可以简单快速地测定生发片中二苯乙烯苷和特女贞苷的含量，专属性强，灵敏度高，重复性好，可以更好地控制生发片质量标准性，同时为含有何首乌和女贞子的制剂质量标准的建立提供参考，可以提高分析效率，降低分析成本。

参考文献

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[4] Park H J， Zhang N， Park D K. Topical application of Polygonum multiflorum extract induces hair growth of resting hair follicles through up regulating Shh and β-catenin expression in C57BL/6 mice [J]. Ethnopharmacol， 2011， 135（2）： 369-375.

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（收稿日期：2016.04.21）