UVA1照射对人工皮肤分泌MMP-1影响的初步研究

[摘要]目的:探讨不同UVA1剂量照射对人工皮肤分泌MMP-1的影响,明确光致人工皮肤损伤的UVA1剂量。方法:通过ELISA法检测不同剂量的UVA1(0～90J/cm2)对人工皮肤表达MMP-1分泌的变化。结果:与0J/cm2相比,UVA1剂量为10J/cm2时MMP-1的分泌量无明显变化(P>0.05),当UVA1剂量大于20J/cm2时人工皮肤分泌MMP-1的量逐渐增高(P

[关键词]长波宽谱紫外线(UVA1);人工皮肤;基质金属蛋白酶-1(MMP-1)

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0348-03

The preliminary study of the MMP-1 secretion in artificial skin in different dose of UVA1

SUN Su-jiao1,2,YAO Lu1,LUO Wen1,SU Shun-qin1,XU Ji-peng1,YNAG Zhi1,HE Li1

(1.Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032,Yunnan,China; 2.Department of Cosmetology, the Affiliated Hospital of Dali College, Dali671000,Yunnan, China)

Abstract:Objective To explored the different dose ofUVA1 irradiation on artificial skin secretion of MMP-1, clearly the UVA1 dose oflight-induced damage in artificial skin. MethodsThe ELISA assay was used to measure the changes of secretion of MMP-1 after different doses of UVA1 exposure(0J/cm2～90J/cm2).ResultsCompared to dose of 0J/cm2, the secretion of MMP-1 of UVA1 dose of 10J/cm2 has no significant difference(P>0.05). When the UVA1 doses greater than 20J/cm2, the secretion of MMP-1 in artificial skin was gradually increased (P

Key words:long-wave wide-spectrum ultraviolet (UVA1);artificial skin;matrix metalloproteinase -1 (MMP-1)

近年来长波宽谱紫外线UVA1(340～400nm)对皮肤的光损伤越来越受到人们的重视,因为UVA1是紫外线中波长最长的一个波段,紫外线的波长越长对皮肤组织的穿透越深。UVA1的主要效应部位是皮肤真皮层,真皮层主要的细胞是成纤维细胞,一些实验证实真皮成纤维细胞产生的基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)与UVA引起的光损伤最为相关[1-2]。本实验应用人工皮肤,力求在一个模拟的更加接近正常人皮肤细胞环境的条件下,应用对皮肤穿透力更强的UVA1照射人工皮肤,观察不同UVA1照射剂量下人工皮肤损伤的情况,通过检测MMP-1的分泌量间接反应人工皮肤特别是真皮的损伤情况。

1材料和方法

1.1 标本来源:人工皮肤购买自陕西艾尔肤公司,产品编号:国食药监械(准)字2007第3461110号。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 主要试剂和材料:MMP-1ELISA试剂盒(ADL公司),无因子角质形成细胞培养基K-SFM(美国Gibco公司),35mm培养皿(Coring 公司)。

1.2.2 仪器:SUV-1000日光紫外线模拟器和辐照计(上海Sigma公司),酶标仪(EL×800/Bio-tek),CO2恒温孵育箱(德国Sigma公司),OLYMPUS BX-50F4显微镜。

1.3 方法步骤

1.3.1 紫外线照射:UVA1剂量=UVA1辐照度×时间(秒),应用上海SIGMA高技术有限公司UVA1辐照度监示器标定SUV-1000日光紫外线模拟器的辐照度。照射时培养皿盖着盖子,在计算强度时应减去培养皿盖衰减的强度。照射时每个培养皿加0.3mlPBS液防止组织变干,照射完毕后用PBS液清洗组织块3次。

1.3.2ELISA法检测MMP-1分泌量:在超净台内配合不锈钢标尺将人工皮肤用手术刀和剪刀分割成5mm×5mm大小移入35mm培养皿中,UVA1照射剂量分组为0J/cm2、10J/cm2、20cm2、30J/cm2、40J/cm2、50J/cm2、70J/cm2、90J/cm2,每组设3个平行孔,照射后将皮片移入24孔板中标号,加入K-SFM培养基0.5ml,至气液界面继续培养24h后行ELISA检测。

1.4 统计分析:实验资料以(x±s)表示,采用Spss13.0统计分析软件中的Student's-t检验对实验数据进行统计分析, P

从表1和图1中可知,当UVA1照射强度为10J/cm2时,人工皮肤分泌MMP-1与0J/cm2比较变化不明显。随着紫外照射强度的增加,人工皮肤分泌MMP-1逐渐增加,当UVA1照射强度为20J/cm2时,与0J/m2比较差异具有统计学意义(P

在以往光损伤的研究中,单层细胞培养、动物实验和正常人皮肤研究光损伤较为多见。但单层细胞的培养无法模拟机体的三维环境,特别是无法模拟光损伤时的穿透性,而动物与人由于种属不同而存在差异,此外应用正常人皮肤由于涉及来源和伦理问题,也较难开展。人工皮肤的出现为许多相关的研究开创了新的道路,因为它在更大程度上模拟了人体的三维环境。人工皮肤构建工艺固定、性质稳定、应用范围广、一致性强,得到的实验结果更具有说服力。更重要的是人工皮肤中含有来源于人并能够代谢的活细胞,因而能够更好地模拟人体内的状态,更加真实地反应人皮肤受到各种刺激后的反应。

MMP-1可作为评估皮肤光损伤特别是真皮成纤维细胞光损伤的一个特异性指标。大量的实验证明紫外线照射可引起成纤维细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs) 增多,特别是UVA的高穿透性使其作用部位位于真皮,成纤维细胞是其作用的主要靶细胞,UVA对成纤维细胞分泌MMPs有较大的影响[3-4]。许多证据表明在人的皮肤上,MMP-1随年龄的增加而增加,并且与紫外线导致的慢性光损伤使胶原排列紊乱、断裂等有密切关系,因此认为MMP-1介导的胶原破坏的累积是皮肤老化(光损伤的重要表现之一)的主要原因[5-6]。Naru等[7]对以真皮成纤维细胞作为体外光老化模型的研究中,观察到UVA1照射正常成纤维细胞后MMP-1 mRNA的表达水平与照射强度呈正相关。UVA1 诱导皮肤产生的ROS,通过MAPK信号传导通路也可促进MMP-1的表达,同时抑制胶原的合成[8]。Fagot D等[2]用3种体外培养的人工皮肤模型(仅含表皮的EPISKIN、含表皮和真皮的复合人工皮、体外培养的正常人皮肤)及体外培养的角质形成细胞和成纤维细胞进行对比实验,发现经紫外线照射后,仅含表皮的EPISKIN和从正常人皮肤中分离出来的角质形成细胞的 MMP-1的分泌不增加,而含表皮和真皮的复合人工皮和体外培养的正常人皮肤MMP-1的分泌是增加的,并且呈现剂量依赖,说明MMP-1可特异性表征真皮光损伤。

应用ELISA法检测培养液中细胞分泌细胞因子量的浓度和浓度变化趋势是一种简单可行的办法,本实验主要是检测MMP-1浓度变化的趋势。我们的结果显示与未照射组相比,当UVA1的剂量在10J/cm2时,MMP-1的分泌稍有增加,但与0J/cm2组相比差异并无显著性意义(P>0.05);自20J/cm2以后MMP-1分泌量逐渐增高,至70J/cm2和90J/cm2时MMP-1的分泌较前有所降低,我们主要是考虑大剂量的UVA1照射导致死亡的细胞增多,因此MMP-1的分泌下降,UVA1照射可诱导人工皮肤高分泌MMP-1的结果与上述许多研究的结果相符。在剂量方面细胞实验多数使用2～10J/cm2的UVA就可导致成纤维细胞分泌MMP-1的值增高,Pascual-Le等[9]用单独的真皮替代物照射紫外线UVA时,使用10J/cm2的照射剂量就可使成纤维细胞分泌MMP-1增高,我们得出的结果偏高,考虑我们使用的是包含了表皮和真皮三维培养的人工皮肤,紫外线穿透表皮时需要损耗一定的剂量,另外我们使用的是波长较长的UVA1,研究认为波长越大的紫外线效能越小,需要使皮肤损伤的剂量就越大[10],从这个角度上说,我们的结果也符合理这个规律。从以上的实验结果我们得出,与未照射组相比,UVA1照射剂量自20J/cm2后对人工皮肤MMP-1分泌就有显著性的影响,说明在该剂量后人工皮肤就出现了光损伤;在照射剂量为50J/cm2以前MMP-1的分泌量呈现剂量依赖性,之后有所下降,说明50J/cm2以后光损伤较严重,这为我们下一步应用人工皮肤研究光损伤时选择合适的照射剂量奠定基础。

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[收稿日期]2009-11-18 [修回日期]2010-01-29