FGF21对H9C2心肌细胞H/R损伤及Angpt2、GLUT1表达的影响

[摘要] 目的 探讨FGF21对H9C2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤及Angpt2、GLUT1表达的影响。方法 体外培养H9C2心肌细胞并分为H9C2组、H/R组、H/R+FGF21组，H9C2组即H9C2细胞阴性对照组，H/R组给予缺氧6 h/复氧24 h处理，H/R+FGF21组则在细胞复氧时给予FGF21（1 μg/mL）处理。利用FCMz测各组细胞凋亡率，QPCR及Western blot检测各组Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表达水平。 结果 H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组（P < 0.01）。与H/R组比较，H/R+FGF21组细胞凋亡率显著降低（P < 0.01）。QPCR及Western blot检测发现，与H9C2组比较，H/R组Angpt2、Caspase-3表达显著增加，GLUT1表达显著降低（P < 0.01）；与H/R组比较，H/R+FGF21组Angpt2、Caspase-3表达显著降低（P < 0.05或P < 0.01），GLUT1表达显著增加（P < 0.05）。 结论 外源性FGF21可显著减轻H/R损伤所致H9C2细胞凋亡，抑制炎症因子Angpt2表达和增加GLUT1表达可能是其内在机制。

[关键词] FGF21；H9C2细胞；缺氧/复氧损伤；Angpt2；凋亡

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0032-05

再灌注治疗是改善急性心肌梗死患者预后的根本措施，其在增加供血、挽救濒死心肌之外，也会引起无复流、心肌细胞凋亡和坏死、再灌注心律失常、心功能恶化等，称之为缺血/再灌注（I/R）损伤。心肌I/R损伤是患者心功能恶化和不良预后的主要原因，其机制复杂，涉及心肌细胞凋亡、能量代谢障碍、炎症损伤等。成纤维细胞生长因子（FGF）21是一种内分泌型FGF，具有抗氧化应激、抗炎、改善能量代谢、抑制心肌凋亡等心血管保护作用[1]，但其内在机制仍不完全清楚。

葡萄糖转运体（GLUT）1是调节心肌细胞有氧糖代谢的关键步骤，是一种内源性保护因子。血管生成素2（Angpt2）是血管生成素家族中最为重要的成员之一，Angpt2作为一种炎症因子参与了多种病理生理过程包括感染性休克、急性心肌梗死、同种异体心脏移植I/R损伤、移植心脏血管病等[2-3]。本研究利用H9C2细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型模拟心肌I/R损伤，旨在探讨外源性FGF21（rhFGF21）对H9C2心肌细胞H/R损伤的保护作用及对Angpt2和GLUT1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 H9C2细胞购买于ATCC（CRL-1446）。

1.1.2 主要试剂 rhFGF21（美国ABNOVA，P5989，纯度> 95%）；DMEM-高糖培养基（Hyclone，Cat.No.SH30022.01B）；胎牛血清（Gibco，Cat.No.10099-141）；Annexin V/PI apoptosis kit（联科生物，AP101）；Trizol（TAKARA公司产品）；RT-PCR试剂（DBI公司产品）；RNasin（美国Promega公司产品）等。

1.1.3 实验仪器 低速离心机（Anke/飞鸽，TDL-80-2B）；CO2细胞培养箱（Memmer，INC108）；缺氧复氧培养箱（SANYO三洋，MCO-5M）；倒置显微镜（MOTIC）；流式细胞仪（BD，FACSCalibur）；酶联免疫监测仪（Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3）；Real Time PCR仪（美国Agilent公司）；SDS-PAGE垂直电泳槽（北京凯元伯乐生物科技有限公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 H9C2细胞H/R模型建立 将H9C2细胞接种于60 mm培养皿中，培养环境为37℃，5%CO2。当细胞密度> 90%时，用于后续实验。10% FBS的DMEM培养基更换为PBS，在缺氧复氧培养箱充入95% N2 10 min后，把缺氧复氧培养箱放入37℃的恒温培养箱中进行缺氧（O2含量约为2%）6 h，然后去掉PBS，重新加入含10% DMEM的培养基，置于37℃，20% O2， 5%CO2中继续培养24 h（即缺氧6 h/复氧24 h）。

1.2.2 给药方法 在细胞复氧时给予rhFGF21治疗，rhFGF21冻干粉直接配置于再灌注液（含10% DMEM的培养基）中，浓度为1 μg/mL，为防止其降解，现配现用，药液不做保存。

1.2.3 实验分组 实验分三组：H9C2组、H/R组、H/R+FGF21组。H9C2组即H9C2细胞阴性对照组，H/R组给予缺氧6 h/复氧24 h处理，FGF21组则在细胞复氧时给予FGF21（1 μg/mL）处理。

1.2.4 检测指标 利用流式细胞仪（FCM）检测各组H9C2细胞凋亡率，利用QPCR及Western blot检测各组H9C2细胞Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；方差不齐进行Kruskal-Wallis H检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡情况比较

H9C2组细胞凋亡率为（9.17±1.12）%（图1A）；H/R组细胞凋亡率为（38.87±3.71）%（图1B）；H/R+FGF21组细胞凋亡率为（24.80±1.95）%（图1C）；H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组（P < 0.01），H/R+FGF21组细胞凋亡率显著低于H/R组（P < 0.01）（图1D）；表明H9C2心肌细胞H/R损伤模型建立成功，FGF21干预可以显著抑制H/R损伤所致H9C2细胞凋亡。

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（收稿日期：2016-10-29 本文辑：李亚聪）