HPLC法测试蓝莓汁中的有机酸

本文作者：胡小露 刘卉 鲁宁 刘佳 高学玲 单位：安徽农业大学茶与食品科技学院 安徽省食品安全分析与检测省级实验室

蓝莓，杜鹃花科(Ericaceae)，越桔属(Vacciniumspp.)[1]，其果实中富含花色素苷[2-4]、酚酸[5-6]、有机酸等多种有效成分，具有降脂、抗癌、延缓衰老、防止血管瘤的发生、治疗糖尿病、改善血液循环等功效[7-9]，其中有机酸不仅直接影响果汁及其果酒的感官品质，同时对花色苷等物质还具有保护作用。蓝莓汁及其发酵酒中的有机酸有原料带来的，也有发酵中代谢产生的，其有机酸的种类及含量因品种及其发酵方式不同而不同。目前，有机酸含量的检测方法较多[10-16]，但关于蓝莓及其制品中多种主要有机酸的高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)同时测定尚未见文献报道。本实验利用气相色谱-质谱联用法(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)定性检测蓝莓汁中几种主要有机酸，再利用HPLC通过等度洗脱方法定量检测蓝莓汁及其发酵酒中主要有机酸含量，可有效地跟踪蓝莓汁及蓝莓酒发酵过程中有机酸含量及其变化规律。

1材料与方法

1.1材料与试剂蓝莓安徽怀宁蓝莓种植基地，于－20℃冻藏；果胶酶(食品级，酶比活力18000U/g)烟台通商国际贸易有限公司；活性干酵母湖北安琪酵母股份有限公司；草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸对照品(纯度＞99%)上海精纯试剂有限公司；甲醇(色谱纯)美国Tedia公司；磷酸二氢铵(分析纯)天津巴斯夫化工有限公司。

1.2仪器与设备600高效液相色谱仪美国Waters公司；FA1104N电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；TGL-16G台式离心机上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型pH计上海精密科学仪器有限公司。

1.3样品的制备方法

1.3.1标准溶液制备分别称取草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸对照品50.0mg，用去离子水定容至10mL，配制成5g/L标准液，根据样品中有机酸含量分别稀释，经0.45μm滤头过滤进样。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2样液的制备取1mg/L蓝莓原汁100μL，－80℃预冻，冷冻干燥24h，采用衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)＋三甲基氯硅烷(TMCS)对样品进行衍生化处理，置120℃干燥50min，待GC-MS定性分析。2mL蓝莓原汁或蓝莓酒，经15000r/min离心20min，0.45μm滤头过滤，待HPLC定量分析。

1.3.3蓝莓酒的发酵工艺流程蓝莓打浆果胶酶酶解取汁糖、酸调整接酵母菌22℃发酵蓝莓酒

1.4HPLC色谱条件色谱柱：WaterssymmetryC18(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样体积5μL；检测波长：210nm；流动相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液，磷酸调pH值为2.0。

2结果与分析

2.1标准工作曲线的建立分别吸取一定质量浓度的有机酸对照品，过滤后进样。以进样量/(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线，见表1，结果表明色谱工作稳定，重现性良好。

2.2GC-MS图谱分析

2.2.1GC-MS定性分析按照1.3.2节方法对样品进行预处理，采用GC-MS对蓝莓汁中主要有机酸进行检测，结果见图1。蓝莓汁中的草酸、柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸，其出峰时间分别为6.925、24.467、28.825、29.042min

2.2.2HPLC定量分析实验选取不同浓度草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸制作混合标准溶液，混合标准溶液色谱图见图2A；同时检测蓝莓汁及其发酵酒样，见图2B、C。可知，9种有机酸的色谱峰分离度较高。

2.3精密度实验取9种有机酸对照品的混合溶液10mL，按1.4节色谱条件连续进样6次，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)，其平均RSD为0.15%(n＝6)。表明该仪器灵敏度高，可用于蓝莓酒中有机酸的检测。

2.4重复性实验精密吸取一定量的蓝莓酒样品6份，经离心、过滤处理后进样分析，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差，得到平均RSD为0.35%(n＝6)，表明该检测方法重现性良好。

2.5加标回收率实验采用加样回收法，精确吸取一定量的蓝莓酒样品5份，分别加入一定浓度的有机酸对照品，经离心、过滤处理后进样检测，记录色谱图，根据峰面积计算回收率，结果见表2，其中有机酸平均回收率为99.52%，平均RSD为0.019%(n＝5)。可见此方法的准确度和精密度均良好，可应用于蓝莓果酒中有机酸含量的检测。

2.6方法的验证为进一步验证方法的可靠性，采用此方法跟踪检测了不同发酵时期蓝莓酒的有机酸含量，结果见图3。对发酵结束后的蓝莓酒每隔10d连续取样4次，采用该方法检测这不同时期蓝莓酒中有机酸的含量，分离效果均较好，目标峰出峰前后无杂质峰干扰，在样品有机酸浓度较低的情况下，杂质峰也未干扰目标物的检测，且主要有机酸目标峰出峰时间稳定、峰形尖锐、分离度高。

3讨论与结语

采用衍生化方法前处理样品[17-19]，利用GC-MS法对蓝莓汁中有机酸进行检测时，只检测出草酸、苹果酸、异柠檬酸、柠檬酸4种主要有机酸，酒石酸未被检出，可能是在样品的低温处理过程中，酒石酸以钾盐等形式析出而导致含量低于检测限而未被检测出。结合相关文献[14-16]及GC-MS定性分析结果，选取草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸作为检测目标，分析蓝莓及其发酵酒的有机酸的含量。HPLC法测定蓝莓汁及其蓝莓酒中的有机酸含量时，由于各种有机酸的洗脱速度相近，导致出峰时间间隔小，实验通过调整流动相组成及配比达到了分离效果。通过调整流动相NH4H2PO4的质量浓度为4g/100mL，pH2.0时可达到较为理想的分离效果。采用流动相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液(磷酸调pH值为2.0)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：25℃；色谱柱：WaterssymmetryC18(4.6mm×250mm，5μm)。通过该方法，蓝莓酒中含有的九种主要有机酸：草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸得到有效的分离并定量，其平均回收率为99.52%，平均RSD为0.019%。结果显示，该方法操作简单，准确度高，无杂质干扰，蓝莓酒样品无需经过复杂的前处理，即可达到良好的分离效果。