外周血淋巴细胞染色体制备影响因素探讨

摘要：目的 通过对不同培养时间及秋水仙素处理条件、滴片高度等进行比较，建立本室较成熟的外周血淋巴细胞染色体制备技术。方法 随机选择5例待测外周血淋巴细胞染色体患者作为实验对象，采集肝素抗凝静脉全血2ml，各接种4瓶，其中培养时间分别为62h、70h，秋水仙素处理条件为1h（终浓度0.2？滋g/ml）、3h（终浓度0.08？滋g/ml），滴片高度为2cm、10cm和30cm。计算不同处理条件下的细胞分裂指数，并对结果进行统计分析。结果 培养62h和70h均可获得较多分裂相，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）；秋水仙素处理3h（终浓度0.08？滋g/ml）的分裂相比处理1h（终浓度0.2？滋g/ml）明显增多（P

关键词：淋巴细胞；培养；秋水仙素；染色体

为减少出生缺陷、提高人口素质，我国目前已经广泛开展染色体分析技术，其中外周血淋巴细胞染色体核型分析是产前诊断的重要组成部分，同时也是研究染色体与临床疾病关系的重要手段。由于本实验操作过程比较繁琐，影响因素很多，各地方的染色体制备效果也略有不同。故为提高本院细胞遗传室染色体的分析效率和结果的准确性，通过对外周血淋巴细胞染色体制备过程中的几个关键环节进行探讨，以建立适合本实验室的较为成熟的染色体制备方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年11月在川北医学院附属医院门诊就诊拟行外周血染色体检测的患者5例，采集肝素抗凝静脉全血2ml备用。

1.2 仪器与试剂 恒温培养箱，恒温水浴锅，离心机，恒温干燥箱，Leica光学显微镜；RPMI1640培养基和秋水仙素（40？滋g/ml）（均购自广州拜迪生物技术有限责任公司），胰酶（日本Sigma），0.075mol/L氯化钾低渗溶液，新鲜配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），磷酸盐缓冲液（pH7.4），吉姆萨染液（购自湖南湘雅基因技术有限公司）。

1.3方法

1.3.1培养时间 吸取250？滋l静脉全血加入5ml培养基中，分别于当天10点和18点各接种2瓶（至加秋水仙素时的培养时间分别为70h和62h）。

1.3.2秋水仙素处理 将2个时间点接种的细胞分为两组，一组以终浓度为0.2？g/ml的秋水仙素作用1h，另一组处理3h（终浓度为0.08？g/ml）。

1.3.3滴片高度 滴片时将处理好的淋巴细胞悬液分别以2cm、10cm和30cm高度各滴冰玻片2张（每张1滴）。

1.4染色体制备 其余步骤参照《现代临床分子与细胞遗传学技术》[1]进行。以细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞数为105～106/L后滴冰玻片。

1.5细胞分裂指数计算：以低倍镜（10×）分别观察每张玻片上细胞滴的左上、左下、右上、右下和中间5个视野，计数细胞总数和分裂期细胞总数，按以下公式计算细胞分裂指数。

细胞分裂指数=分裂期细胞总数/总细胞数×100%

1.6计量资料以均数 标准差表示，运用统计软件SPSS16.0的t检验对结果进行统计分析，以P

2结果

2.1培养时间 同一标本经培养62h和72h后再用秋水仙素进行处理，均可获得足够的分裂相，统计结果显示培养时间比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

注：*P>0.05

2.2秋水仙素处理结果 经不同浓度和不同时间的秋水仙素作用后，均获得较多分裂相，其中终浓度为0.08？滋g/ml处理3h组的分裂相比终浓度为0.2？g/ml处理1h组明显增多，差异有显著性（P

注：*P

2.3滴片高度 油镜观察不同高度滴片后染色体的分散程度，2cm、10cm和30cm滴片上的染色体均分散良好。见图1。

2cm高度 10cm高度 30cm高度

图1 不同滴片高度对染色体分散的影响

3讨论

随着生命科学和医学科学的发展，人们的优生优育意识增强，尤其我国计划生育政策的实施使得人民在少生的同时更渴望得到健康生殖[2]，家族中的遗传病史是否对其后代有影响？不良生育史夫妇是否能生育一个健康的宝宝？反复自然流产是否由染色体异常引起的呢？诸多的问题困扰着患者，同时也等待我们去探讨解决。外周血淋巴细胞染色体分析虽然不能将所有的遗传问题解决，但却不失为解疑答惑的有力工具。

外周血淋巴细胞染色体制备包括细胞培养、细胞同步化、细胞低渗、细胞固定、细胞老化和显带等步骤，本次针对细胞培养时间、秋水仙素处理条件和滴片高度等几个环节进行探讨。参照其它实验室或教科书的经验，外周血淋巴细胞培养的时间一般为68～70h，故本实验室将待测染色体分析的外周血采集严格限定在上午10点～12点，假如当天下午的申请单只能延续到下一个采集日进行，不仅影响临床工作的开展，而且无形中浪费了患者的时间和金钱。故本实验选取上午10点与本院下午下班的时间点（18：00）进行接种，发现两时间点培养的淋巴细胞分裂指数之间无差异（P>0.05）。张清健等[3]研究显示培养72h是人淋巴细胞分裂最旺盛的时期，此时进行同步化可获得最多的分裂相，时间过短或过长均降低细胞分裂指数，可能得不到满意的分裂相进行后续分析。本实验显示两时间点均可获得足够的分裂相进行核型分析，在此时间范围的申请单皆可受理，不会因为培养时间的缩短而影响结果的分析。提示外周血淋巴细胞培养时间可能勿需那么严格。

秋水仙素是一种生物碱[4]，可抑制或破坏纺锤体微管的形成，从而将细胞同步化于分裂期，秋水仙素的剂量和作用时间的长短对分裂期细胞的数量和染色体的长度有影响，假如加入的量过多或处理时间长，虽然获得的分裂相多但染色体浓缩、长度短、带纹少，不利于核型分析；反之假如加入的秋水仙素量少或作用时间短，获得的分裂相少或没有分裂相，染色体虽然带纹多但太细太长，也不利于分析[5]。刘爱生等[6]研究显示在阻断培养的4h内任意时间加入相应剂量的秋水仙素，能获得形态完好、大小适中、分散均匀、轮廓清楚的中期染色体标本相。本实验室使用终浓度为0.2%的秋水仙素处理1h后可获得较多的分裂相，但长度适中的染色体（比如550条带左右）不多，本次改为低浓度的秋水仙素（终浓度为0.08？滋g/ml）作用3h后，细胞分裂指数明显增加（P

总之，通过本次实验将本实验室外周血淋巴细胞染色体制备的细胞培养时间确定为62～70h，秋水仙素作用条件为终浓度0.08？滋g/ml处理3h，可在2cm左右高度滴片。在后续工作中应用此条件也获得了满意的染色体玻片，使得染色体分析工作简单易行。该条件可作为其他实验室的参考，但每个实验室最好在工作中不断总结经验、建立适合自身的外周血淋巴细胞染色体制备条件。

参考文献：

[1]丁显平.现代临床分子与细胞遗传学技术[M].第1版.成都：四川大学出版社，2002.

[2]左.医学遗传学[M].第5版，北京：人民卫生出版社，2004.

[3]张清健，郑立新，田佩玲等.人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究[J].癌变.畸变.突变，2013，25（1）：63-64.

[4]张丽华，邹向阳.细胞生物学和医学遗传学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2010.

[5]熊晓芸.秋水仙素浓度对人体外周血淋巴细胞染色体制备的影响[J].江苏预防医学，2009，20（2）：54-56.

[6]刘爱生，朱春燕.秋水仙素在人类染色体G显带制作中的应用与讨论[J].卫生职业教育，2012，30（23）：107-108.编辑/许言