猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和线粒体电位的影响

摘要：目的：探讨猫爪草皂苷(Radix rannculus temate saponins，RRTS)对人结肠癌LoVo细胞的增殖和凋亡作用及作用机制。方法：按猫爪草皂苷浓度分为1、10、100、500μg・mL-14个处理组和对照组(未加猫爪草皂苷)，处理LoVo细胞不同时间后，倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT法检测细胞增殖的抑制情况；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果：与对照组比较，猫爪草皂苷处理组可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多；MTT法检测显示，猫爪草皂苷处理组随着浓度的增加和作用时间延长，对LoVo细胞的增殖抑制作用增强，并呈时间、剂量依赖性(P

关键词：猫爪草皂苷；结肠癌LoVo细胞；细胞增殖；细胞凋亡；线粒体膜电位

中图分类号：11737.25　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2009)05-1079-03

猫爪草系毛茛科植物小毛茛(Ranunculus tematusThunb)的块根，性平，味甘、辛，归肝、肺经。有解毒、化痰散结之功能，临床上用于治疗肺结核、颈淋巴结核、咽喉炎、淋巴癌、甲状腺肿瘤及乳腺肿瘤等疾病。王爱武博士发现猫爪草皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌MCF27细胞的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关。早期研究报道，猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn值相反，猫爪草有效成分对肿瘤坏死因子有诱生作用。基于此，本研究观察猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞体外增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制。

1　材料

1.1　细胞　人结肠癌细胞株LoVo购于中南大学湘雅中心实验室。

1.2　药物和主要试剂　猫爪草皂苷为河南中医学院第一附属医院中心实验室提供；罗丹明123(Rhodaminel23)荧光探针，Sigma公司。

1.3　主要仪器　倒置显微镜，日本Olympus公司；全自动酶标仪，奥地利；流式细胞仪，Coulter，USA；激光共聚焦系统，德国Lcica公司。

2　方法

2.1　猫爪草皂苷作用的观察①细胞毒性测定(MTT法)用含10％胎牛血清的RPM11640液调细胞浓度为1×104/孔，接种于96孔板，过夜培养，次日实验组加入不同浓度的皂苷，其终浓度分别为1、10、100和500μg・L-1，对照组只加等量的PBS液，每组设6平行孔，将培养板置于5％CO2、37℃培养箱中，继续培养24、48和72h，在额定时间将每孔加入MTF20p,L，继续培养4h，吸去上清液，加入DMSO(150μL/孔)，混匀10rain后，在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度A值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100％。②流式细胞仪(FCM)测定细胞周期和凋亡率不同浓度皂苷处理LoVo细胞，同时设阴性对照组，于24h后PBS洗涤后收集细胞，加入预冷的乙醇(浓度为70％)，于4℃固定24h，离心洗涤后，悬浮于PI染液中，最后以300目筛网过滤，调整细胞浓度为1×106・mL-1，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长488nm，用Mulficycle DNA分析软件行细胞周期的测定。

2.2　激光共聚焦扫描技术观察线粒体膜电位的变化细胞的处理：取对数生长期LoVo细胞，经消化、吹散、重悬于10％小牛血清RPMll640培养液中，调整细胞浓度为5×104％dl・L-1。加入内置盖玻片(多聚赖氨酸浸泡，晾干)的6孔培养板内2.5mL，培养24h后分别在不同时段加入含皂苷(100μg・L-1)小牛血清10％的RPM11640培养液中，于4h、8h、12h等时相点终止培养进行观察，另设不加入皂苷的为对照。罗丹明荧光探针标记：皂苷对细胞作用不同时间后，Rh0123 10μg・mL-1染色，在37℃，5％CO2培养箱温育15min，PBS洗3次。用激光共聚焦观察线粒体膜电位的变化：每组选择不同视野的单个细胞，用激光共聚焦显微镜的图像分析系统(TCS～Tool)分析整个胞内的荧光强度(膜电位变化以荧光强度表示)，统计不同作用时间细胞的荧光值，计算的变化。

2.3　统计学方法　用SPSS 10.0统计软件包，进行，检验。

3　结果

3.1　细胞形态学观察结果　倒置显微镜下观察，经皂苷处理12和24h后，部分细胞贴壁脱落，悬浮于培养液中，细胞变圆，体积减小，核固缩，核颜色加深，折光性增强，其中500μg・mL-1皂苷作用24h最明显，细胞数少，脱壁细胞明显增多。对照组细胞贴壁生长，细胞呈多角形，胞质饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片。

3.2　猫爪草皂苷对LoVo细胞的抑制作用

不同浓度皂苷作用24、48、72h后，LoVo细胞的生长均不同程度地受到抑制，并呈浓度和时间依赖性特点，其中以500μg・mL-1皂苷在72h时抑制率为最高。皂苷处理组LoVo细胞生长抑制率与对照组比较，差异均有显著性(P

3.3　流武细胞仪定量分析　与对照组相比，24h后各组随着药物浓度的增加，G1期细胞数量增多，S期、G2期细胞下降，见表2。凋亡率分别为7.1％、13.7％、18.0％和27.4％，差异显著(P

3.4　激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的变化100μg・mL-1皂苷作用4h细胞荧光含量(134.55±7.68)显著减弱，8h为(111.16±9.30)，12h后细胞的线粒体膜电位强度进一步下降(92.97±11.44)。各组与对照组(215.26±12.58)差异显著(P

4　讨论

肿瘤细胞无限增殖是肿瘤发生发展的主要原因。如长春花碱、紫杉醇、三尖杉碱、喜树碱等常用抗肿瘤药物，作用于肿瘤细胞生长的不同阶段，使细胞生长所需要的DNA、RNA、蛋白质合成受到严重阻碍，从而使肿瘤细胞停止于增殖周期的某一时相，或作用于肿瘤细胞能量代谢的某一环节，导致肿瘤细胞呼吸链受阻死亡，或破坏细胞膜引起细胞自溶死亡。本观察显示，猫爪草皂苷可阻滞结肠癌LoVo细胞于S、G2期，以致癌细胞不能顺利进入下一周期，并有量效正相关系。

大量实验证实，许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱，并认为它的出现是导致细胞不可逆死亡的关键环节。在肿瘤细胞凋亡早期，线粒体首先出现形态改变，同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差(ψm)密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着与细胞凋亡有关的因子Bel-2/Bax、钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡，因此，被认为是凋亡调节中心。线粒体在进行电子的呼吸链传递时，将质子从线粒体的内膜基质侧泵到内膜外，而内膜不允许质子回流，因此造成膜内外的电化学梯度，这里既有H浓度梯度，又有跨膜电位差。正是这种跨膜电位在维持线粒体膜的完整性和功能方面起重要的作用。本实验皂苷作用LoVo细胞后短时间内(4h)可诱导线粒体改变，和Johnson等用地塞米松引起淋巴细胞线粒体变化的时间相近。说明线粒体数量变化或转膜电位改变，其反应速度很快。随着皂苷作用时间的延长，显示的荧光强度逐渐减弱，表明细胞跨膜电位强度不断下降，而电位下降会严重影响线粒体的功能，细胞内线粒体中呼吸链的代谢紊乱直至中断，破坏线粒体膜的完整性，发生细胞凋亡。