内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应

摘要：试验以从表面灭菌的稗草中分离到的一株内生固氮菌ＨＡＵＭ１０为对象，研究发现该菌具有较强的产固氮酶和吲哚乙酸能力。乙炔还原法测定其所产固氮酶的活性为０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ・ｈ），液相色谱法测定其产吲哚乙酸量为１５．４４ μｇ／ｍＬ。将ＨＡＵＭ１０用ｇｆｐ基因标记后接种水稻，观察其在水稻中的侵染定殖规律，发现在接种后第7天，ｇｆｐ标记的ＨＡＵＭ１０主要定殖于根内通气组织和韧皮部细胞，少量定殖在叶鞘中。盆栽试验表明，ＨＡＵＭ１０促进水稻叶绿素合成，有利于光合作用，在水稻生长后期促进氮、磷元素由叶向穗转移。

关键词：内生固氮菌；水稻；侵染；定殖；促生

中图分类号：Ｓ１５４．３８＋１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1257-06

Infection and Colonization of Endophytic Diazotroph HAUM10 on Rice Seedlings

and Its Plant Growth-Promoting Role

ＴＡＯ Ｙａｎ－ｈｕｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Aｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ ＨＡＵＭ１０ ｗａｓ ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｕｒｆａｃｅ－ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓｇａｌｌｉ and it ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ． Ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＡＲＡ） ｗａｓ ａｂｏｕｔ ０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ・ｈ）． Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ determine the ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＡＵＭ１０ which was detected as ｕｐ ｔｏ １５．４４ μｇ/ｍL． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｂｙ ｇｆｐ－ｔａｇｇｅｄ ＨＡＵＭ１０ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ． ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ａｅｒｅｎｃｈｙｍａ ａｎｄ ｐｈｌｏｅｍ ａｔ the 7th day ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ； While a few was ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｓｈｅａｔｈ． Ｐｏｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＨＡＵＭ１０ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ the ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｔｏ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｒｉｃｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ； ｒｉｃｅ； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ

水稻生长过程除了需要大量的水外，氮源是其最重要的生长因子。中国是世界上稻米的主要生产国和消费国之一，目前化肥是实现单位面积高产的重要因素之一，但中国占世界约７％的耕地面积中施用的氮肥高达全球氮肥总用量的３５％以上［１］。氮肥进入灌溉稻田后，通过氨的挥发、硝化－反硝化作用、表面流失等多途径损失，最终导致氮肥利用率降低。大量氮素损失导致一系列环境问题：地下水污染和江河湖泊的富营养化；饮用水中硝酸盐浓度高于１０ ｍｇ／Ｌ将导致婴儿高铁血红蛋白症和成人胃癌；Ｎ２Ｏ和ＮＯ的排放可能导致全球气候变暖［２］。生物固氮不仅可以为植物提供氮源缓解施用化肥带来的一系列危害，而且具有环保、高效、节能、高效等优点，因此研究利用生物固氮的方式为水稻提供氮源具有极其重要的意义。

植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物ＤＮＡ的方法来证明其内生性［３］。内生菌对宿主植物的促生效应包括固氮、解磷、分泌植物激素、促进矿质元素吸收、生物防治等［４］。植物内生固氮菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ）是一类能定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的微生物。由于内生固氮菌在农作物体内不仅具有固氮活性，而且可能分泌植物激素等多种生物活性物质促进作物生长，因此，利用内生固氮菌对植物的促生效应，有可能开辟一条不同于根瘤菌与豆科作物互作促生的途径。考虑到与水稻生长环境相似、常与水稻发生营养竞争关系的稗草中可能存在某些有促生作用的内生固氮菌，故将稗草作为内生固氮菌分离的材料，研究了其中一株内生固氮菌在水稻中的侵染定殖规律及对水稻的促生效应。

１ 材料与方法

１．１ 材料

内生固氮菌来源：ＨＡＵＭ１０由华中农业大学微生物学国家重点实验室自华中农业大学实验基地的稻田沟渠稗草中分离得到。ＨＡＵＭ１０单个菌体短杆状，不形成芽孢，具有运动性，革兰氏阴性。在营养琼脂平板上生长，单个菌落平滑，菌落淡黄色，半透明，中间凸起，粘着于培养基上；在无氮阿须贝氏培养基平板上，菌落透明黏稠，边缘不规则向周围扩展生长。根据ＨＡＵＭ１０的生理生化性质和１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列比对结果，鉴定ＨＡＵＭ１０是一株泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）。

含ｇｆｐ基因的供体菌：大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）ｃｃｌｌ８λ／ｐＦＡＪ１８２０，卡那霉素抗性［５］。由比利时鲁汶大学Ｊ． Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ教授馈赠。

三亲本杂交辅助菌：Ｅ． ｃｏｌｉ（ｐＰＫ２０７３，Ｓｐｅ Ｒ）。

１．２ 方法

１．２．１ 扩增固氮酶ｎｉｆＨ基因，测定固氮酶活性 首先用碱变性法［６］抽提HAUM10总ＤＮＡ，并稀释100倍后作为模板。固氮酶ｎｉｆＨ基因扩增引物和反应程序参考Ｕｅｄａ等［７］的方法。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后用ＤＮＡ纯化试剂盒回收，回收产物连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化入ＤＨ５α，挑阳性克隆测序。

乙炔还原法测纯培养的内生固氮菌所产固氮酶活性［６］。将改良的Ｄｏ氏培养基［８］３ ｍＬ分装于ＰＡ瓶中灭菌后制成斜面，取等量内生固氮菌接种于Ｄｏ氏培养基，２８ ℃培养４８ ｈ后将ＰＡ瓶上的硅胶盖换成不透气的橡胶塞。用注射器平衡瓶内外压力后，抽出１０％体积的空气，注入等体积的乙炔，继续在２８ ℃下培养２４ ｈ。气相色谱仪测定乙烯生成量。

１．２．２ 产吲哚乙酸试验 ＣＣＭ培养基［９］：葡萄糖５ ｇ，甘露糖５ ｇ，苹果酸５ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ １ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ５．８，加色氨酸０．２ ｇ／Ｌ。接种菌体于ＣＣＭ培养基中，生长１周；１０ ０００ ｇ离心１５ ｍｉｎ，收集上清液；ＨＣｌ调节上清液ｐＨ为２．８；用等体积的乙酸乙酯抽提3遍；提取物４０ ℃水浴旋转蒸发真空浓缩至近干，然后加１ ｍＬ无水乙醇悬浮；ＨＰＬＣ检测：采用Ｃ１８色谱柱，Ｖ甲醇∶Ｖ醋酸∶Ｖ水＝３０∶１∶７０为流动相，流速１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，λＩＡＡ＝２８０ ｎｍ［１０］。

１．２．３ ｇｆｐ基因标记ＨＡＵＭ１０及接合子的鉴定 以抗生素利福平作为三亲本杂交试验受体菌的筛选标记，驯化ＨＡＵＭ１０，得到抗１００ μｇ／ｍＬ Ｒｉｆ的ＨＡＵＭ１０。

三亲本杂交方法参考赵斌等［６］的方法。为了得到稳定表达的ｇｆｐ接合子，将三抗平板上得到的接合子菌体在无抗性的液体ＬＢ培养基中传20代，然后将菌液稀释１０７倍涂三抗（Ｒｉｆ １００ μｇ／ｍＬ，Ｓｐｅ ５０ μｇ／ｍＬ，Ｋｍ ３０ μｇ／ｍＬ）ＬＢ平板，即可得到较为稳定的ｇｆｐ接合子。

鉴定转化子：在荧光显微镜下观察菌体是否发出绿色荧光，是否在三抗阿须贝氏培养基上生长；ＰＣＲ扩增菌体ｇｆｐ基因：挑转化子于三抗ＬＢ培养基生长至对数期后，取菌液３０ μＬ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，倒掉上清液加入５０ μＬ无菌去离子水并摇动均匀，１００ ℃、５ ｍｉｎ后置冰上５ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取１ μＬ上清液作为模板。ｇｆｐ引物的设计：从ＧｅｎＢａｎｋ中搜索到ｇｆｐ基因的序列，根据ｇｆｐ基因全长设计引物。Ｇｆｐｆ为５′－ＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡ

ＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣ－３′，Ｇｆｐｒ为５′－ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ－３′。反应体系（２０ μＬ）：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ和ｄＧＴＰ浓度均为２ ｍｍｏｌ／Ｌ）２ μＬ；正反向引物（５０ μｇ／ｍＬ）各０．８ μＬ；模板ＤＮＡ（１０ ｎｇ/mL）１ μＬ；Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ；加水至２０ μＬ。反应程序：９４ ℃，预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５７ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃继续延伸１０ ｍｉｎ。

１．２．４ ＨＡＵＭ１０在水稻中的侵染定植路径 水稻（中花１１）种子表面灭菌处理参考文献［１０］的方法。将灭菌后的水稻种子铺于１％琼脂固体培养基中萌发５ ｄ，选择健壮的幼苗剪少许根后移入２０ ｍＬ装有水稻无氮营养液配置的半固体培养基（琼脂浓度３．２５ ｇ／Ｌ）的玻璃试管（口径２．５ ｃｍ，长１９ ｃｍ）中。接入无菌水悬浮的ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ。管底作避光处理后，置智能光照培养箱（光照２７ ℃，１６ ｈ/d；黑暗２５ ℃，８ ｈ/d）培养。

于接种后３、５、７ ｄ分别取水稻幼苗，无菌水洗去表面附着菌体。在连续变倍体式显微镜下用不锈钢刀片切取水稻组织制作切片。激光扫描共聚焦显微镜λ４８８ｎｍ激发光下观察水稻各部位内生固氮菌存在状态。

１．２．５ ＨＡＵＭ１０纤维素酶和果胶酶试验 纤维素酶试验采用赵斌等［６］的纤维素水解试验方法一。配制果胶培养基［６］，０．１ ＭＰａ灭菌５ ｍｉｎ倒平板，每个平板点种４株菌株，２８ ℃倒置培养２～４ ｄ。

１．２．６ 盆栽试验观察ＨＡＵＭ１０对水稻生长的影响 盆栽试验设不接种（ＣＫ）和接种ＨＡＵＭ１０两种处理，各４个重复，每个重复１盆（盆口径２０．５ ｃｍ，高１９.0 ｃｍ，土深１４.0 ｃｍ）。水稻种子表面灭菌后，置于添加无菌水的平皿中，２８ ℃萌发５ ｄ后，倒掉无菌水，加入无菌水悬浮的菌液浸苗过夜。每盆２５棵苗，等距种植。水稻生长过程浇自来水和无氮Ｆａｈｒａｅｕｓ营养液。待水稻生长至分蘖期和灌浆期再各接种一次内生固氮菌剂。移栽后分别在第７、１４、２１、３０、４５天取样，将植株完全拔出后自来水冲洗干净。观察内生固氮菌在水稻不同部位的消长动态，不同时期测ＨＡＵＭ１０在水稻体内的固氮酶活性［１０］。移栽后第４５天取水稻苗测叶片的叶绿素含量［１１］。第４５天和种子收获期取样消化［１２］后以凯氏定氮法和钼锑抗比色法分别测水稻氮和磷含量。

２ 结果与分析

２．１ ＨＡＵＭ１０固氮酶基因ｎｉｆＨ及固氮酶活性

ｎｉｆＨ基因是蛋白酶多肽的３个功能基因ｎｉｆＨＤＫ之一，扩增片段大小为３９０ ｂｐ（图１）。测序结果在ＮＣＢＩ数据库中经ＢＬＡＳＴ比对，与成团泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）的ｎｉｆＨ序列覆盖率为７５％，同一性为９６％。乙炔还原法测定ＨＡＵＭ１０的固氮酶活性为０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ・ｈ）。

２．２ 产吲哚乙酸试验结果分析

高效液相色谱法测定吲哚乙酸标准品的出峰时间是１１．０２０ ｍｉｎ（图２ａ），确定ＨＡＵＭ１０发酵液出峰时间为１１．１７３ ｍｉｎ的峰图是其所产吲哚乙酸的峰图（图２ｂ），可得ＨＡＵＭ１０产吲哚乙酸量为１５．４４ μｇ／ｍＬ。

２．３ ｇｆｐ标记菌株的鉴定

ＨＡＵＭ１０与供体菌、辅助菌接合后，在选择性三抗培养基上产生了一些接合子，而单独的供体菌、辅助菌、受体菌在这样的选择性培养基上均不能生长。将其接种于无氮三抗培养基上，接合子可生长，单独的供体菌、辅助菌、受体菌不生长。用无选择压力的液体ＬＢ培养基传20代后，在三抗ＬＢ培养基上筛选稳定的接合子，此时在ＺＥＩＳＳ荧光显微镜蓝色激发光下明显看到每个单菌落发出明亮的荧光。挑取ｇｆｐ稳定表达的接合子单菌落液体培养后取菌液，ＰＣＲ扩增ｇｆｐ片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图３。从图3可以看出，经ＰＣＲ扩增后，ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ和阳性对照Ｅ． ｃｏｌｉ ｃｃｌｌ８λ／ｐＦＡＪ１８２０都产生了分子量相同的惟一一条电泳带（片段大小约７９０ ｂｐ），而野生型的ＨＡＵＭ１０未产生任何条带。

２．４ ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ在水稻中的侵染定殖

试验发现，水稻苗接菌后，在水稻根周围１～３ ｍｍ内可见云雾状细菌群围绕，说明HAUM10主要通过根部侵染进入稻体，而在未接菌的水稻根的周围没有此现象。激光扫描共聚焦显微镜观察未接菌对照的水稻根，横切面内没有绿色荧光标记的菌体侵染定殖（图４ａ）。接种后第3天，用普通荧光显微镜观察发现水稻根毛区聚集大量内生固氮菌，附着于根表面（图４ｂ）。第5天，激光扫描共聚焦显微镜观察发现水稻表皮细胞和皮层细胞有少量ｇｆｐ标记的ＨＡＵＭ１０。第7天，根内ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ数量增多，内生固氮菌主要分布于皮层细胞和韧皮部细胞，当薄壁细胞萎缩径向壁相互重叠形成通气腔后，在通气组织中可看到HAUM10－ｇｆｐ（图４ｃ）；在叶鞘横切面和纵切面也可见较多的ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ，主要存在于韧皮部细胞和薄壁组织中（图４ｄ和图４ｅ）。试验发现，在维管束中有极少量ｇｆｐ基因标记的菌体。

２．５ ＨＡＵＭ１０所产纤维素酶和果胶酶的活性

接种两周后观察ＨＡＵＭ１０分解纤维素的试验结果，发现接种ＨＡＵＭ１０的滤纸条比未接菌对照滤纸条变薄。根据纤维素分解菌具有将纤维滤纸分解使其失去原有物理性状的性质，说明它可以产生纤维素酶分解纤维素。ＨＡＵＭ１０在果胶培养基上培养后，在菌体生长区域培养基颜色由黄色变为蓝色（培养基中添加了酸碱指示剂），且菌落周围的培养基出现下凹（图５）。根据果胶可以使液体培养基胨化，果胶被分解，胨状培养基被液化，培养基表面会出现下凹的原理，说明ＨＡＵＭ１０在生长过程中能够分泌果胶酶。

２．６ 盆栽试验结果分析

通过盆栽试验，观察ＨＡＵＭ１０在水稻不同部位的消长动态，在接种后第7天水稻根、茎、叶内都已经有HAUM10侵染定殖。接种后第7天时，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别为１０８、１０６、１０３ ＣＦＵ／ｇ；第１４天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是１０７、１０６、１０３ ＣＦＵ／ｇ；第２１天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是１０５、１０４、１０２ ＣＦＵ／ｇ，第３０天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是１０３、１０２、１０ ＣＦＵ／ｇ。ＨＡＵＭ１０在水稻体内迁移路径是从根到茎再到叶，菌量表现为根＞茎＞叶。第7天测得ＨＡＵＭ１０在水稻鲜根的固氮酶活性为５．６７４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ・ｈ），第１４天为４．８３７ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ・ｈ），第２１天为０．９１ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ・ｈ），第３０天为０．３０１ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ・ｈ），第４５天为０．１３２ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ・ｈ）。接种ＨＡＵＭ１０第４５天后水稻鲜叶叶绿素ａ含量和总叶绿素含量分别为２．８６８和４．１４３ ｍｇ／ｇ，分别比对照增长５１．９％和１９．１５％；地上部分、地下部分全氮含量分别为１１７．６０、５２．３４ ｇ／ｋｇ，分别比对照增长２９．３９％、４８．８６％，全磷含量分别为１９．１８、１０．３１ ｇ／ｋｇ，分别比对照增长３０．１２％、１２．４３％；收获期水稻叶片接种ＨＡＵＭ１０的全氮、全磷含量分别为１２９．６０、８．５０ ｇ／ｋｇ，分别比对照下降２６．８２％、１５．１７％（表１）。

３ 讨论

内生细菌通过黏附作用吸附在植物细胞的表面，这对细菌侵染定殖有很好的促进作用。试验中发现水稻根毛区聚集较多的ＨＡＵＭ１０，附着于根上。大多数内生菌都具有分解纤维素和果胶的能力，有助于其穿透植物细胞壁，进入植物体内部［１３］。同样，对ＨＡＵＭ１０进行的研究发现其果胶分解能力比较强。运动性试验说明ＨＡＵＭ１０可能具有鞭毛，这有利于其发挥主动运动性，向有利于其生存的环境移动，同时可以开辟更广阔的生存空间。显微切片发现ＨＡＵＭ１０主要定殖于根和叶鞘的皮层细胞和韧皮部细胞，可能这些部位细胞有利于其生存。Ｇｙａｎｅｓｈｗａｒ等［１４］利用免疫金标记技术研究发现，固氮型内生菌粘质沙雷氏菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）可以定殖于水稻根、茎、叶中，在细胞间隙、衰老根的皮层细胞、通气组织和木质部导管中有大量该菌定殖。Ｊｈａ等［１５］利用ｇｕｓＡ标记克雷伯氏产酸菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ＧＲ－３，通过组织染色发现新生侧根处极有可能是该菌侵染进入水稻根内的主要部位。

高效液相色谱法分析ＨＡＵＭ１０产吲哚乙酸的情况，由色谱图可知ＨＡＵＭ１０能分泌吲哚乙酸，而且还有其他许多未知物质产生，某些物质的分泌量比吲哚乙酸多。这些未知物质可能是其他植物激素，对宿主植物有促生作用或有助于植物进行无机盐运输、营养分配等。ＨＡＵＭ１０可分泌生长激素，可能在植物体内也通过分泌植物激素的方式对宿主起促生作用。ＩＡＡ可促进水稻根的伸长，增加根系与土壤接触面积，从而有利于吸收环境中的营养物质，如矿质元素和水，最终增加植物的生物量［１５］。Ｍａｔｔｏｓ等［１６］用Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ接种水稻，认为Ｂ． ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ可产生吲哚乙酸，使植株侧根和根毛增多。

盆栽试验是在水稻种子萌发５ ｄ后接种ＨＡＵＭ１０，是因为在萌发时接种有助于该菌充分与水稻根接触，达到促根目的，使根系强大，为培育壮秧打下坚实基础；另外，有助于该菌占领根系，排除盆栽外环境中其他杂菌的干扰［１７］。对收获期水稻叶中氮、磷含量分析发现，接种ＨＡＵＭ１０的水稻叶中氮、磷含量均比未接菌水稻叶中氮、磷含量低，分析可能是ＨＡＵＭ１０在水稻生长后期对营养物质由叶运输至穗发挥了一定的作用。沈德龙等［１８］利用１４Ｃ同位素标记技术研究了水稻内生成团泛菌ＹＳ１９在水稻子粒乳熟初期和乳熟后期对光合产物在源、库中的分配和影响，发现水稻内生成团泛菌可以调控光合产物在旗叶（源）、穗（库）中的分配，在水稻子粒乳熟初期，喷施ＹＳ１９菌液有助于旗叶光合产物向穗的运输，而向根、叶鞘运输的光合产物很少，在乳熟后期则有抑制作用，原因是与ＹＳ１９菌株产生的激素有关。

综上所述，可以判断从稗草中分离的ＨＡＵＭ１０可以侵染定植于水稻中，这是其促生性质被广泛利用的基础。ＨＡＵＭ１０对水稻的促生效应包括固氮、产生生长激素、有助于水稻叶绿素合成促进光合作用以及水稻生长后期氮、磷元素由叶向穗转移。

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［９］ ＲＥＮＮＩＥ Ｒ Ｊ． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌｅｎｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ （ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ） ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８１，２７（１）：８－１４．

［１０］ ＧＯＶＩＮＤＡＲＡＪＡＮ Ｍ， ＢＡＬＡＮＤＲＥＡＵ Ｊ， ＫＷＯＮ Ｓ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｇｒａｉｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００８，５５（１）：２１－３７．

［１１］ 王学奎．植物生理生化实验原理和技术［Ｍ］．第二版． 北京：高等教育出版社，２００６．１３０－１３３

［１２］ 鲁如坤．土壤农业化学分析方法［Ｍ］．北京：中国农业科学技术出版社，２０００．

［１３］ ＣＯＭＰＡＮＴ Ｓ， ＲＥＩＴＥＲ Ｂ， ＳＥＳＳＩＴＳＣＨ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ． ｂｙ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＰｓＪＮ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，７１（４）： １６８５－１６９３．

［１４］ ＧＹＡＮＥＳＨＷＡＲ Ｐ，ＪＡＭＥＳ Ｅ Ｋ， ＭＡＴＨＡＮ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｙ ａ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１， １８３（８）：２６３４－２６４５．

［１５］ ＪＨＡ Ｐ，ＫＵＭＡＲ Ａ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｈａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ｂｙ ａ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ｓｔｒａｉｎ ＧＲ－３［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， １０３（４）：１３１１－１３２０．

［１６］ ＭＡＴＴＯＳ Ｋ Ａ， Ｐ?ＤＵＡ Ｖ Ｌ Ｍ， ＲＯＭＥＩＲＯ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｂｙ ｔｈｅ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］． Ａｎａｉｓ ｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉêｎｃｉａｓ， ２００８， ８０（３）：４７７－４９３．

［１７］ 颜思齐，杨大旗，肖建国．水稻丰收菌［Ｍ］．北京：科学技术文献出版社，１９９２．５４－５７．

［１８］ 沈德龙，冯永君，宋 未．内生成团泛菌ＹＳ１９对水稻乳熟期光合产物在旗叶、穗分配中的影响［Ｊ］． 自然科学进展，２００２， １２（８）：８６３－８６５．