酶抑制法在蔬菜检测中的应用探讨

【摘要】 由于农业生产的需要，必然会使用农药进行病虫害的防治。尽管现今无公害农产品的种植面积不断扩大，但是农药残留的问题仍是人们非常关心的一个民生问题。酶抑制法即生化法就是一种简便、灵敏、经济、快速的检测方法，它可将抽查的蔬菜样本先进行粗筛，将有残毒问题的蔬菜再用气相色谱仪等分析仪器进一步定性和定量分析，本文从现今的农药残留检测技术以及检测技术的展望进行初步的讨论。

【关键词】 农药残留;酶抑制法;气相色谱法;测定

目前我国有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的分析方法有气相色谱法、薄层色谱法以及快速测定方法―酶抑制法。气相色谱法虽是国家标准方法，但要求条件较高，必须具备气相色谱仪并配有火焰光度检测器(FPD)或氮磷检测器(NPD），有适合的色谱柱等，需要昂贵的仪器设备；薄层色谱法检测方法繁杂，操作难度较大；酶抑制法虽然不是国标法，但具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点，适合水果蔬菜上市前农药残留毒性的检测，受到基层疾病预防控制机构的普遍欢迎。

1 材料与方法

1.1 试剂配制（1）pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与362g磷酸二氢钾，用 1000ml蒸馏水溶解。(2)显色剂4g/L：分别取80mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6 mg碳酸氢钠，用20ml缓冲溶液溶解，置于4℃冰箱中保存。(3)底物21.67g/L：取65mg硫代乙酰胆碱，加3.0ml蒸水溶解，摇匀后，置4℃冰箱中保存备用。(4)乙酰胆碱酯酶：3.0mg/L用缓冲溶液溶解，摇匀后，置4℃冰箱中保存备用。(5)有机磷标准储备液：将从国家农药质检中心购买的甲氨磷、敌百虫、乐果、克百威和灭多威饵品用丙酮配制成1g/L的溶液。标准使用液临用前配制。

1.2 使用仪器 CL-F2000残留农药测定仪(上海复淳软件科技发展有限公司)；气相色谱仪：上海天普分析仪器有限公司GC900A高性能气相色谱仪。

1.3 操作方法 每个样品做平行样，首先在试管中加入有机磷标液后，然后分别加入3.0ml缓冲液，50μl乙酰胆碱酯酶液，100μl显色剂，摇匀后，在37℃放置15min，加入40μl底物；在0.5min内混合均匀，30s后，立即用F2000测定仪进地测定，F2000型快速测定仪记录1min酶抑制率I%，CK为酶活性的大小。

计算公式：回收率(%)=（I%/I0）×100

式中I%―(菜 +标)提取后测定的抑制率减去菜的空白抑制率；

I0%―直接测定加入农药抑制率。

2 结果与讨论

2.1 条件选择

2.1.1 酶活性的测定 分别加入20、40、80μl酶，其他试剂为缓冲溶液3ml，显色剂100μl，底物20μl。测定结果可见，1、2、3 min的线性相似。但酶活性随着酶的数量增加而增加。随着时间的变化，酶的活性不断下降。因此，测定的时间应定为 1或 2 min之内。酶量较少时，灵敏度较低，但酶量大时，灵敏度虽高，但变化较快，使反应不稳定，故取中间值50μl的酶量较佳。

2.1.2 温度、时间、底物与条件的选择 在室温放置与水浴37℃放置酶的活性不同，37℃放置15和20min，酶的活性也不同。实验结果表明，温度过低与时间过长，酶的活性均较低；37℃放置15min反应，酶的活性较高。底物应足够量，否则，反应不够完全。故取40μl底物为佳。

2.2 标准曲线的测定 将 6种农药1g/L的丙酮标准储备液，用蒸馏水稀释为甲氨磷10mg/L，毒死蜱100mg/L，敌百虫0.1mg/L，乐果100mg/L，克百威1mg/L，灭多威10mg/L。抑制率：甲氨磷为84.55%，毒死蜱为98.45%，敌百虫为94.32 %，乐果为48.43 %，克百威为92.76 %，灭多威为88.85 %。克百威、敌百虫的相关系数可达到0.99，其他几种农药达到0.96～0.9，由此证明本方法可以作为筛选方法，确证还需要经过气相色谱法测定。

2.3 回收率 在蔬菜中添加农药，用快速测定仪测定，见表1。表1 回收率测定结果由此可见，蔬菜中加标的回收率为85%～105%，能满足实验要求。

2.4 精密度 按照2.3添加农药标准，用快速测定仪测定。由此可见精密度范围在0.9%～4.3%，满足实验要求。

2.5 样品测定结果 将加标样用快速检测方法和气相色谱法测定，样品取样量为10.0g。测定结果表明，两种方法测定结果基本一致。

3 结论

综上所述，可以得出快速测定法―酶抑制法能够可满足大批样品农药残留的筛选，但对于抑制率超过30%的样品，应及时进行气相色谱的分析，以进一步确定农药的种类和浓度。

4 展望

随着人民群众对农产品质量安全的日益关注，以及各级检测部门的重视，酶抑制法以其灵敏性和准确性高及成本低等优点，农药残留技术必将向朝着更加快速方便、灵敏可靠的方向发展：（1）提升速度，提高精度。现今，酶抑制法从样本制备到得出结果，需要至少20分钟左右，而一些精度较高的仪器，确要花更多的时间去完成样本制备、试剂预处理等环节，需要的时间将更长，这与农产品交易频繁的地方的检测要求不相适应。对于未来的检测方法必将在提升检测速度、提高检测精度方面下功夫，简化预处理的时间，研制出能快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的试剂盒，加快检测的速度，使之符合农产品现场检测的需要；（2）开发研究检测范围更广的农药残留检测方法，使之能适应现今农药种类繁多的现状；（3）加大对农药残留速测仪的研究力度，制作集成化高的仪器，使一台仪器能够完成整个的检测过程，方便携带和现场检测。

参考文献

[1]王军、朱鲁生、林爱军等. 农药残留速测技术研究进展[J]. (环境污染治理技术与设备), 2001,2(1):17~20

[2]涂忆江.我国农药残留快速检测技术的研究和应用现状[J], (农药科学与管理), 2003, 24(4):14~16

[3]王恒亮. 张保民.王兰芝等. 酶活性抑制测定农药残毒技术研究[J]. (河南农业科学), 1997,1:25~26