XAV939对卵巢癌细胞增殖的作用

卵巢癌是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，由于难以早发现、早诊断以及治疗效果差等原因，严重威胁着女性的生命和健康。近年来，国内[1]外研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与一些恶性肿瘤的发生发展密切相关，另外，有证据显示，该[2,3]信号通路在卵巢癌的增殖、侵袭及转移中也发挥着重要的作用，是目前卵巢癌发病机制研究的热点之一，因此Wnt/β-catenin信号通路也被视为卵巢癌治疗的一个潜在靶点。是新近发现的/β[4-6]XAV939Wnt-catenin信号通路的小分子抑制剂，能特异性地抑制转录因子β-进而抑制多种肿瘤细胞增殖[7-catenin，9]，但在卵巢癌细胞中尚缺少相关研究，因而本研究旨在观察XAV939对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。

1材料和方法

1.1细胞培养人卵巢癌细胞株OVCAR3购自ATCC细胞库，用含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液，于饱和湿度、37℃和5%CO条件孵箱中培养，2~3d换液传代21次，取对数生长期细胞进行实验。1.2MTT法观察细胞增殖抑制率将细胞浓度调整为1×10/L，接种于96孔培养板，每孔200μl，设置实验组和空白对照组，每组设3个复孔。分别孵育0、24、48、72h，实验结束前4h加入5g/L的MTT20μl，37℃孵育4h后弃上清，加入150μl的二甲基亚砜（DMSO），置酶标仪测490nm波长处的吸光度（A）值，计算不同浓度XAV939(购自上海惠诚生物科技有限公司)作用不同时间的抑制率。1.3流式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期OVCAR3细胞，计数，以61.0×10/孔接种于6孔板，常规培养使细胞贴壁。设置实验组和对照组，每组3个重复，每24h换液一次；48h后终止培养，PBS洗涤细胞2次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS再洗涤2次，5ml70％的冰乙醇固定至少2h。离心后冷PBS洗涤细胞2次，加入500μlRNase(0.25mg/ml)，37℃孵育30min。50μg/ml的碘化丙啶(PI)4℃避光染色，1h内流式细胞仪检测。1.4流式细胞仪检测细胞凋亡收集对数生长期OVCAR3细胞，计数，以61.0×10/孔接种于6孔板，常规培养使细胞贴壁。设置实验组和对照组，每组3个重复，每24h换液一次；48h后终止培养，PBS洗涤细胞2次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集细胞，1BindingBuffer洗涤(重悬、离心)2次，加入200μl1BindingBuffer重悬细胞，加入10μlAnnexinV-FITC，低速涡旋混匀，室温避光染色15min，再加入300μl1BindingBuffer及5μlPi，室温避光染色5min后流式细胞仪检测。1.5Westernblot检测蛋白表达水平收集对照组及实验组A2780细胞，提取蛋白质，测定蛋白含量后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离蛋白。电泳条件为100V2h。电转移至硝酸纤维素膜上，条件为50V2h。TBST洗膜3次（5min/次）后用5%脱脂奶粉封闭1h。将一抗(CyclinD1兔抗、Bcl-2兔抗均购自ProteinTech，PARP1兔抗购自博奥森生物技术有限公司)按说明书稀释，并与膜一起封闭到塑料膜内，4℃过夜。经TBST洗膜后加抗兔IgG-HRP二抗（购自DAKO），室温2h。化学发光、显影、定影。洗膜后显色。统计分析应用SPSS统计软件进行分析，数据以表示，进行t检验。

2结果

2.1XAV939对卵巢癌细胞增殖的影响MTT法结果显示，XAV939可以明显抑制OVCAR3细胞的增殖并呈现剂量依赖性和时间依赖性（图1）。2.2XAV939对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响细胞周期检测结果显示，经XAV939作用的卵巢癌细胞发生G1期阻滞，即处于G1期的细胞所占比例明显增加，且4μM、8μM、16μM剂量组和对照组之间存在显著性差异（图2-A）。另外，凋亡检测结果显示，XAV939可促进OVCAR3细胞凋亡，使其凋亡率明显上升，且4μM、8μM、16μM剂量组的凋亡率和对照组的凋亡率之间存在统计学差异（图2-B）。2.3Westernblot观察XAV939对卵巢癌细胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表达以及PARP剪切片段水平的影响结果显示XAV939作用后：（1）OVCAR3细胞的CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平呈浓度依赖性递减；（2）而PARP剪切片段水平相对于未经XAV939作用的对照组来说明显增高（图3）。

3讨论

卵巢癌是威胁女性生命的常见恶性肿瘤之一，由于发病隐匿、缺乏有效的早期诊断方法、治疗效果不佳等原因，其死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤[1]的首位，且呈现逐年上升的趋势。近年来，卵巢癌的病因及发病机制一直是研究的热点问题，涉及了多种分子遗传学改变以及多种信号通路及信号分子[10,11]表达的异常。Wnt信号转导通路是近年来研究发现的与肿瘤发生发展密切相关的通路，包括非经典通路和经典通路。在卵巢癌的发生机制中，经典Wnt信号通路则是近几年来研究的热点，而其关键分子β-[12]catenin的稳定性调节是该通路的核心机制。当细胞外因子Wnt蛋白与其受体（β-catenin/APC/axin复合体）结合时，该复合物对β-catenin的降解减少，导致β-catenin在胞浆内大量累积并转运如核内，进而与核内转录因子（Tcf/Lef）结合，启动下游靶基[12]因的表达，诱发细胞异常增殖。目前，以经典Wnt信号通路为靶点的抗癌治疗基础研究及临床前期实验已在多种恶性肿瘤中展开。研究显示，作为一种小分子选择性抑制剂，XAV939能够特异性地抑制β-catenin的转录、促进[9]β-catenin降解，对包括乳腺癌、胃癌等在内的多[8,9]种肿瘤细胞有抑制作用。在本实验中，细胞周期检测结果显示XAV939的作用使卵巢癌细胞发生G1期阻滞，同时，Westernblot观察到XAV93作用的卵巢癌细胞中cyclinD1的表达明显下降。CyclinD1是一种重要的细胞周期调节蛋白，在细胞由G1期到S期的转化过程中起着关键的作用。有研究认为，cyclinD1可能在卵巢癌的发生发展中产生一定的影响：一方面，cyclinD1是KRAS/BRAF/MEK/MAPK信号通路中的一个下游靶点，而该通路中的基因突变是卵巢癌的主要发病机[10,11,13]制之一；另一方面，cyclinD1也是经典Wnt信号通路下游的众多靶基因之一，而该通路正是近几年[12]卵巢癌发病机制的研究热点。本研究中，cyclinD1在用XAV939处理的卵巢癌细胞中的表达水平显著降低，细胞由G1期转化至S期的过程受到阻碍，进而抑制了其增殖。Bcl-2是一种重要的细胞凋亡抑制基因，在细胞凋亡的线粒体途径中起到抑制细胞色素C释放、抑制细胞凋亡的作用，在肿瘤的发生发展中起到重要的[14]作用。有研究报道，Bcl-2在卵巢癌中的阳性表达率高于正常卵巢组织，且未分化癌组织和低分化癌[15]组织中的表达更为显著，这提示Bcl-2基因的过表达促进了卵巢癌的发生发展。本研究中Westernblot结果显示，XAV939的作用使Bcl-2在卵巢癌细胞中的表达明显减少。多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)Polymerase，PARP]是一种DNA修复酶。当各种不良因素导致细胞DNA损伤后，PARP识别、结合到损伤处并被激活，[16]进而启动修复机制。不过，除了通过修复受损DNA实现对细胞的保护作用，PARP还参与细胞凋亡的过程。作为半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，PARP的水解被视为细胞程序性死亡的一个早期分子[17]标志。当细胞启动凋亡程序时，PARP被Caspase3[17]剪切而丧失其作为DNA修复酶的活性。在本研究中Westernblot结果显示，卵巢癌细胞中PARP剪切片段水平显著上升，这与细胞凋亡实验检测到细胞凋亡率增加的结果相一致。综上所述，本研究结果表明XAV939作为特异性β-catenin抑制剂，能够在体外对卵巢癌细胞的增殖产生重要影响，从而也为卵巢癌的治疗提供了新的可能。

作者：方婉侠 陈说 赵杨 单位：中国医科大学附属第一医院妇产科